12个主产区历史小麦品种抗叶锈病基因分析

段振盈 徐新玉 李 星 李在峰 马 骏 姚占军

（1河北农业大学农学院/华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室，071001，河北保定；2河北农业大学植物保护学院/河北省病虫害生物防治工程技术研究中心，071001，河北保定；3中国农业大学农学院，100193，北京）

由叶锈菌（Pucciniatriticina）引起的小麦叶锈病是气传性真菌病害，其危害性大、易侵染且传播距离远[1]。叶锈菌秋季侵染幼苗并向临近传播，以菌丝体潜伏在叶片内或以夏孢子越冬，待温度适宜，菌丝体或夏孢子便开始复苏产生新孢子侵染寄主，导致病害发生和流行[2-3]。病害发生年份减产5%～15%，流行年份减产 40%甚至更高[4-6]。据统计，我国每年小麦种植面积约0.23亿hm2，叶锈病发生面积约0.15亿hm2，特别是西南、西北和长江中下游麦区发生严重[7]。受气候变化和耕种方式改变的影响，我国叶锈菌生理小种多样性呈增加趋势，各小麦主产区都存在多个叶锈菌流行小种，其中分布较广、危害较大的是THTT、THTS、THSS、PHTT和THKS[8]。当前，该病害防治主要依靠合理的抗病品种布局、栽培管理和药剂施用等措施[9]。由于药剂防治耗时耗力，增加农业生产成本，且污染环境。因此，通过杂交育种聚合抗病基因来培育新的抗病品种[10-11]是抑制小麦叶锈病流行的重要途径[12]。

我国小麦品种资源丰富，可从中筛选出优秀的抗源材料。目前，利用基因推导和分子标记检测相结合是鉴定小麦抗病基因最快速便捷的方法。郑慧敏等[13]在70份小麦品种（系）中利用12个与已知抗叶锈病基因紧密连锁的分子标记，结合基因推导和系谱分析，推导出Lr1、Lr2a、Lr26、Lr3ka、Lr11、Lr17、Lr30、Lr10等15个抗叶锈病基因，并筛选出 39份慢锈品种，可为小麦抗叶锈病育种提供抗源材料；张林等[14]利用基因推导法对山东省12个主栽小麦品种（系）进行抗叶锈性基因分析，推导出Lr1、Lr16、Lr26、Lr37等抗叶锈病基因；焦悦等[15]在来自国外的50个小麦品种（系）中推导出Lr1、Lr26、Lr34、Lr37等8个抗叶锈病基因，并筛选出19个慢锈品种（系）。通过对国内外小麦生产品种进行基因推导分析，明确其中的抗叶锈病基因及筛选出慢锈性品种，为今后品种的合理布局和抗病育种提供理论支持。

随着小麦叶锈病抗性研究的不断发展，已经发现100多个抗叶锈病基因，正式命名至Lr79[16]。其中Lr10、Lr14a、Lr16、Lr17、Lr26、Lr34、Lr35和Lr36等基因在田间已基本丧失抗病性，仅Lr9、Lr19、Lr24、Lr38、Lr45、Lr78和Lr79等仍具有良好的抗病性[17]，因此鉴定小麦品种中含有的抗叶锈病基因，对培育抗叶锈病品种具有重要意义。本研究利用苗期基因推导法、分子标记检测与系谱分析对 12个小麦品种进行抗叶锈病基因检测，成株期根据田间病情指数筛选出慢锈性品种。

1 材料与方法

1.1 材料

供试小麦材料及菌株为12个小麦品种、35个含已知抗叶锈病基因的近等基因系、感病对照品种郑州5389、成株慢锈对照品种SAAR、19个不同毒性的叶锈菌生理小种和田间接种所用的混合生理小种（THTT、THTS和PHTT），均由河北农业大学小麦叶锈菌研究室保存并提供，所用菌株均由流行菌株在温室中分离纯化获得。叶锈菌生理小种依据Long[18]提出的叶锈菌密码命名系统进行命名。

1.2 方法

1.2.1 苗期侵染及基因推导 35个近等基因系、感病对照品种郑州5389和12个小麦品种经催芽后种植于温室育苗穴盘中，待小麦生长至一叶一心时，采用扫抹法接种19个不同毒性的叶锈菌生理小种，依据Roelfs等[19]的分级标准进行抗叶锈病鉴定，并根据Dubin等[20]提出的方法进行基因推导。基因推导法以Flor[21]提出的基因对基因假说为原理，依据不同叶锈菌生理小种对 35个近等基因系的侵染型来鉴别生理小种的毒性谱，并将相同的生理小种接种到待测品种，通过待测品种对这些菌系的抗感表现推导其含有的抗性基因。

1.2.2 分子标记检测 用 CTAB 法[22]提取供试材料的小麦幼叶全基因组 DNA，参照 Sharp等[23]的方法，使用分光光度计测定其浓度和纯度，稀释至40～50ng/µL的PCR工作液，利用12个与已知抗叶锈病基因紧密连锁的分子标记进行检测。20µL PCR反应体系为2µL DNA模板、2µL引物、10µL 2×TaqPCR Mix和6µL ddH2O。反应程序及引物序列见表1。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳或12%非变性聚丙酰胺凝胶电泳进行检测。试验独立重复2次。

表1 分子标记的引物序列及PCR扩增程序Table 1 Primer sequences and PCR amplification programs

1.2.3 成株期抗性调查 2017和2018年10月下旬将12个小麦品种、感病对照品种郑州5389和慢锈对照品种 SAAR采用人工撒种条播[35]于河北农业大学试验田（115.47°E，38.85°N）。小麦返青后（约4月初）进行接种，将菌种（THTT、THTS和PHTT）混合后用0.03%吐温20制成0.3～0.5g/L孢子悬浮液，用喷雾法接种于诱发行，接种后覆膜，黑暗保湿 14～16h，揭去地膜后自然生长。待郑州5389发病严重度至50%时进行第1次调查[36]，记录苗期侵染型、发病普遍率和严重度，并计算病情指数[37]，之后每隔1周调查1次，直至感病对照品种郑州5389严重度高于90%，一般调查3次。

2 结果与分析

2.1 小麦苗期侵染结果

参考Colin等[38]的方法进行基因推导（表2），携带Lr2c、Lr3、Lr16、LrB、Lr3bg、Lr23和Lr33的载体品系对 19个生理小种均表现为感病，晋麦2148、小偃6号、温麦6号这3个品种的抗性谱与其相同或相似，尚不能确定其中是否含有抗叶锈病基因。平阳27、石特14、烟农15这3个供试品种对叶锈菌生理小种均表现为抗病，含有已知抗叶锈病基因Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr42、Lr47和Lr51的载体品系对叶锈菌生理小种均表现为抗病，但平阳27的表现型高于Lr9、Lr19、Lr28、Lr47和Lr51载体品系的表现型，推测平阳 27中不含Lr9、Lr19、Lr28、Lr47和Lr51；且对菌种PHGL、TGKS和PHTS的表现型高于Lr24和Lr29的载体品系，推测其不含Lr24和Lr29；对菌种FHSQ、PHDQ、PHGL、TGKS和PHTS的表现型高于Lr42的载体品系，推测其不含Lr42；同理推测出石特14、烟农 15中均不含有Lr9、Lr24、Lr19、Lr28、Lr29、Lr42、Lr47和Lr51。这3个品种在接种19个叶锈菌生理小种后表现出良好的抗性，可能含有其他未知基因，无法依靠现有的近等基因系推断出其含有的抗叶锈病基因。石新 828仅对菌种 TGKS表现为抗病，对其他小种均表现为感病；济南 2号对FHDQ①、FHGQ②、TGKS、FHJS②生理小种均表现为抗病，对其他小种均表现为感病；碧蚂 4号对FHJR、FGBQ、FHDQ①、FHGQ②、FHJT、TGKS、FHJS②和FHDQ②表现为抗病，对其他小种表现为感病；碧蚂1号对FGKQ和FGBQ 2个生理小种表现为抗病，对其他小种表现为感病。这4个品种对19个叶锈病生理小种的抗性谱与任一载体品系的抗性谱均不相同，推断其可能含有其他未知抗病基因。百农3217及Lr1的载体品系对PHDQ、TGKS生理小种均表现为感病，但百农3217的抗性谱较宽，因此推测百农3217中含有Lr1和其他未知基因。泰山 1号及Lr26的载体品系对 FGKQ、FGBQ、TGKS表现为抗病，且泰山1号的抗性谱较宽，推测泰山1号中含有Lr26和其他未知抗病基因。

表2 35个载体品系、12个供试品种及感病对照品种郑州5389对19个菌系苗期抗性鉴定结果Table 2 The results of identification of resistance of 35 vector lines, 12 tested varieties and the control variety Zhengzhou 5389 to 19 pathotypes of P.triticina at seedling stage

续表2 Table 2 (continued)

2.2 分子标记检测结果

通过12个与已知抗叶锈病基因紧密连锁的STS和 SCAR分子标记进行分析。分子标记检测结果（图1）显示，在供试品种中扩增出与Lr34（150bp）、Lr37（259bp）、Lr1（760bp）、Lr26（1076bp）、Lr46（520bp）抗叶锈病基因大小相同的目的片段，未扩增出与抗叶锈病基因Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24大小相同的目的片段，由此推测供试品种中不含抗叶锈病基因Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24。其中与Lr34连锁的标记引物csLV34在石特14中扩增出相应的特异性片段，表明石特14中可能含有Lr34（图1a）；与Lr37连锁的分子标记在泰山1号和温麦6号中均扩增出相应的特异性片段，表明泰山1号和温麦6号中可能含有Lr37（图1b）；与Lr1紧密连锁的标记引物WR003在石特14中扩增出相同的特异性片段，表明石特14可能含有Lr1（图1c）；与Lr26连锁的正相关分子标记引物ω-secalin在泰山1号和石特14中均能扩增出特异性片段，并且用负相关分子标记Glu-B3均未扩增出特异性片段，表明泰山1号和石特14中可能存在抗病基因Lr26（图1d和图1e）；石新828、济南2号、泰山1号、晋麦2148、烟农15、小偃6号和温麦6号中均扩增出Lr46的特异性片段，推测这7个小麦品种中含有成株抗叶锈病基因Lr46（图1f）。

图1 12个小麦品种中含有的抗叶锈病基因分子标记检测结果Fig.1 PCR amplification and molecular marker detection results of 12 wheat varieties

2.3 小麦成株期抗性调查结果

2017-2018和2018-2019年度供试品种与对照品种严重度、普遍率调查结果见表3。感病对照品种郑州5389在2个环境下均充分发病，保证了试验结果的准确性。慢锈对照品种SAAR在田间的严重度在2个环境下均为1，为明显的慢锈性。根据NY/ZB 592.2-2007，苗期侵染型等级为3级及3级以上且病情指数严重度×普遍率＜30%为慢锈性品种[39]。百农3217、平阳27、济南2号、泰山1号、石特14、晋麦2148、碧蚂4号、烟农15、小偃6号、温麦6号共10个品种在田间对混合叶锈菌生理小种苗期侵染型为3级或以上，成株期严重度均小于30%，且病情指数较小，表现慢锈性。综合2年度调查结果筛选出以上10个小麦品种为慢叶锈性品种，可为培育抗病品种提供抗源材料。

表3 12个供试品种、慢锈对照SAAR和感病对照郑州5389成株期对混合小种侵染型、严重度、普遍率和病情指数结果Table 3 Infection types to Puccinia triticina, final disease severity, general rate, disease index results of 12 tested varieties, slow rust cultivar SAAR and susceptible cultivar Zhengzhou 5389

3 讨论

通过查询品种系谱分析得出，百农3217由（阿夫×内乡5号）×咸农39为母本、西农64×偃大24为父本杂交选育而来，阿夫是2个意大利小麦品种Duecentodieci与Damiano的杂交后代[40]，于1956年引入我国，刘新春等[41]在阿夫中检测到抗叶锈病基因Lr1，通过基因推导在百农3217中发现Lr1，推测百农3217的抗叶锈性来源于阿夫。晋麦2148是以（晋江赤子×华东5号）×欧柔为母本、瑞托为父本杂交而来，丁艳红等[42]推测欧柔中含有抗叶锈病基因Lr34、Lr16、Lr11、Lr3bg和Lr33，由此推测晋麦2148的抗叶锈性来源于欧柔。百农3217和晋麦2148中均检测出抗叶锈病基因Lr1，Lr1最早由Mclntosh等[43]定位在5DL染色体上，随后被成功克隆[44]。据报道，Lr1目前已丧失抗性，但与其他抗病基因共同存在时仍能表现良好的抗性，百农3217和晋麦2148成株期表现出良好的抗性，可能含未知抗病基因，与基因推导结果吻合。济南2号（蚂蚱麦/碧玉麦//早洋麦）、碧蚂1号（蚂蚱麦/碧玉麦）与碧蚂4号（蚂蚱麦/碧玉麦）的遗传背景相似，均包含蚂蚱麦和碧玉麦，孟倩等[45]在蚂蚱麦中检测到慢锈性基因Lr34，但通过分子标记在济南2号、碧蚂1号、碧蚂4号中均未检测出Lr34，可能是在杂交过程中发生遗传重组或抗叶锈病基因Lr34的丢失，因此其抗性可能由其他抗性基因提供。魏新燕等[46]在碧蚂 1号中检测到抗病基因Lr35，本试验中推导出碧蚂1号中含有未知抗病基因，未对抗叶锈病基因Lr35进行检测，是否为相同的抗叶锈病基因有待进一步验证。平阳27、济南2号、石特14、晋麦2148、烟农15、小偃6号和温麦6号表现慢锈性可能是慢锈基因Lr46和其他加性效应基因共同作用的结果。其中平阳27、石特14和烟农15在苗期对19个叶锈菌生理小种均表现抗病，在田间对毒性较强的混合生理小种表现感病，且侵染型在3级及以上，推测其抗病基因表达可能受多基因互作和环境条件的影响。Lr46来源于品种Pavon 76，被定位在1BL染色体上[47]。该基因为慢锈性基因，目前在田间仍具有良好抗性。本研究利用与Lr46紧密连锁的分子标记在7个小麦品种中检测出成株期抗病基因Lr46，其中有6个小麦品种在成株期表现慢锈性，与检测结果一致；石新 828中仅检测到Lr46，但成株期病情指数高于30%，表明其抗病性可能受环境微观影响或存在Lr46的抑制基因，其具体原因有待进一步验证。

本研究结合基因推导、系谱分析和分子标记检测多种方法，对 12个小麦品种抗叶锈病基因进行了分析。基因推导法方便快捷、检测周期短，能够在短时间内对大量品种进行检测，但由于该方法仅依靠人为因素对小麦侵染型进行鉴定，通过病原物与植物之间相互作用后的侵染型来判断供试品种中所含有的抗性基因，可能判断错误导致错过某些抗性基因，所以存在一定的局限性。此外，有些小麦品种遗传背景丰富，系谱复杂，可能存在多个抗性基因，基因间的互作效应也可能影响推导结果。因此，结合系谱分析一定程度上弥补了基因推导法的不足。分子标记检测法操作简便，利用分子标记对供试品种进行检测，不受环境因素、发育时期、遗传背景、菌种毒力和基因互作等因素的影响。田间成株期抗性鉴定利用人工接种毒性较强的叶锈菌生理小种，自然诱发并结合作物的真实生长环境更具有说服力。为保证试验结果的准确性，本试验以基因推导法为基础，结合系谱分析、分子标记检测和成株期抗性鉴定，对供试品种抗叶锈病基因进行分析，试验结果更具有说服力。

4 结论

综合苗期基因推导、系谱分析及分子标记检测结果，在12个小麦品种中发现Lr1、Lr26、Lr34、Lr37和Lr465个抗叶锈病基因，其中2个品种含Lr1，2个品种含Lr26，1个品种含Lr34，2个品种含Lr37，7个品种含Lr46，3个品种在利用现有条件下并未发现抗叶锈病基因。通过成株期抗性鉴定筛选出百农3217、平阳27、济南2号、泰山1号、石特14、晋麦2148、碧蚂4号、烟农15、小偃6号和温麦6号共10个慢叶锈性品种，这些小麦品种中含有1个或多个抗叶锈病基因，可为后续培育新的小麦抗病品种提供抗源及理论支持。