mTOR 信号通路在Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预小鼠肝纤维化进程中的作用及其机制

王荣华，单长锋，王建英，赵子建，李芳红

1.广东工业大学生物医药学院，广东广州510006；2.温州医科大学眼视光学院生物医学工程学院，浙江温州325035

肝纤维化是肝脏对反复损伤后的一种修复反应，也是各种慢性肝病进展中由于细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）合成与降解失衡导致ECM 在肝脏内过度沉积的动态过程［1-2］。肝纤维化具有渐进性及一定的可逆性，在适当阶段加以治疗及干预，可有效阻止甚至逆转肝纤维化进程［3］。

Omega-3 多不饱和脂肪酸（Omega-3 polyunsaturated fatty acid）主要由二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）组成，自1978 年DYERBERG 等发现生活在格陵兰岛的因纽特人因在食物中大量摄入Omega-3多不饱和脂肪酸，使冠心病、血栓等疾病的发病率及死亡率显著低于其他人群以来，Omega-3 多不饱和脂肪酸对人体的许多重要生理作用逐渐被发现，特别是其对细胞生长及炎症的生物学作用，目前已成为许多慢性疾病饮食治疗及干预的研究热点［4-10］。mTOR 信号通路在细胞生长调控中的作用目前已被人们所认识，其与肝纤维化的发生发展密切相关［11-14］。

本研究以mTOR 信号通路为切入点，在四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型的基础上，探讨mTOR 信号通路在Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预小鼠肝纤维化进程也中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 食品级DHA ／ EPA 油为84.76%高纯度鱼油（含约26.49%DHA，约50.84%EPA），购自上海贺普实业有限公司（批号：20190527-EPA50DHA-25EE）；CCl4溶液（批号：XW00562352）购自国药集团化学试剂有限公司；药用级玉米油（批号：C116-025）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；苏木素伊红染色试剂盒（批号：C0105）、内源性过氧化物酶强力封闭液（批号：P0100B）、RIPA 裂解液（批号：P0013B）、苯甲基磺酰氟（PMSF，批号：ST506）、SDSPAGE 蛋白上样缓冲液（批号：P0015L）均购自上海碧云天生物技术有限公司；Masson 染色套装（批号：G1006）及天狼星红染液（批号：G1018）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；驴血清（批号：abs935）购自爱必信（上海）生物科技有限公司；免疫组化抗原修复缓冲液（批号：ZLI-9067）、SP 试剂盒（批号：SP-9001）及 DAB 显色试剂盒（批号：ZLI-9017）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；PierceTMBCA Protein Assay Ki（t批号：23225）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；Affinity ECL ki（t批号：KF003）购自美国Affinity Biosciences 公司；异氟烷（批号：R510-22-16）购自瑞沃德生命科技有限公司；兔抗小鼠α-SMA 单抗（批号：CST19245S）、兔抗小鼠 COL1A1 多抗（批号：CST84336S）、兔抗小鼠 mTOR 单抗(批号：CST2983S）、兔抗小鼠S6 单抗（批号：CST2217S）、兔抗小鼠p-mTOR单抗（批号：CST5536S）、兔抗小鼠 p-S6 多抗（批号：CST2211S）、兔抗小鼠GAPDH 单抗（批号：CST5174S）、兔抗小鼠 Bcl-xL 单抗（批号：CST2764S）、兔抗小鼠PCNA 单抗（批号：CST13110S）、HRP 羊抗兔抗体（批号：CST7074P2）及HRP 马抗鼠抗体（批号：CST7076P2）均购自美国Cell Signaling 公司；兔抗小鼠Bcl-2 单抗（批号：ab182858）购自英国Abcam 公司；鼠抗小鼠β-actin 单抗（批号：A2228）购自美国 Sigma 公司；鼠抗小鼠Fibronectin 单抗（批号：sc-271098）购自美国Santa Cruz 公司。

1.2 实验动物 SPF 级 C57BL ／ 6 小鼠 20 只，雄性，7 ～ 8 周龄，体重（23.297 ± 0.878）g，由华南理工大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（粤）2017-0178。

1.3 小鼠肝纤维化模型的建立及分组处理 将20只C57BL ／ 6 小鼠随机分为对照组、4 周模型组、8 周模型组及治疗组，每组5 只。模型组及治疗组小鼠经腹腔注射含 20% CCl4的玉米油溶液，5 mL ／ kg，每周2 次，诱导建立肝纤维化模型；对照组小鼠经腹腔注射等剂量玉米油，除4 周模型组注射4 周外，其余3 组持续注射8 周；治疗组在造模的同时从第4 周开始给予小鼠灌胃 EPA ／ DHA，4 g ／ kg，每日 1 次，对照组及8 周模型组给予等剂量生理盐水灌胃。在造模完成后24 h 内观察记录小鼠体重及毛发色泽；使用过量异氟烷麻醉，迅速剖开腹腔记录肝脏大体形态并摘取小鼠肝脏，用冰生理盐水快速冲洗，以滤纸吸干水分后称重，计算肝脏指数（肝脏重量占总体重的百分比），取肝右叶制成石蜡切片；其余肝组织放入液氮迅速冷冻后于-80 ℃冻存。

1.4 肝组织病理学检查 小鼠肝组织用10%中性甲醛固定24 h 脱水后，按常规包埋切片步骤制成4 ～5 μm 石蜡切片，分别进行 HE 染色、Masson 三色染色及天狼星红染色，以中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.5 肝组织中肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）活化标志蛋白（α-SMA）、抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL）及细胞增殖核抗原蛋白（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表达水平的检测 采用免疫组织化学染色。各组小鼠肝组织石蜡切片经梯度浓度乙醇脱蜡后水化，用柠檬酸钠抗原修复液进行抗原修复，内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min；PBS 洗涤3次，加入 5%驴血清（1 ∶20 稀释），室温封闭 1 h；加入抗 α-SMA 抗体（1 ∶650 稀释）、抗 Bcl-2 抗体（1 ∶500 稀释）、抗Bcl-xL 抗体（1 ∶1 000 稀释）、抗 PCNA抗体（1 ∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜；PBS 洗涤 3 次，滴加生物素标记IgG，室温孵育1 h；PBS 洗涤3 次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min；PBS 洗涤 3 次，DAB 及苏木素染色。

1.6 肝组织总蛋白的提取 取各组适量肝组织，加入用 RIPA 裂解液（500 μL）和 1% PMSF 配制成的裂解液混合物，置研磨仪进行研磨。4 ℃，7 317 × g 离心20 min；取上清，用PierceTMBCA Protein Assay Kit进行定量分析，用SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液将各组蛋白样品均稀释为 2 μg ／ μL，金属浴煮沸 5 min，使蛋白变性，分装为 20 μL ／管，于-80 ℃冻存。

1.7 肝组织中HSC α-SMA 蛋白、促纤维化蛋白（Collagen1A1、Fibronectin）表达水平及 mTOR 信号通路中mTOR、S6 蛋白磷酸化水平的检测 采用Western blot。取等量（30 μg）蛋白，经 5% ～ 12% SDS-PAGE分离后转移至PVDF 膜上，加入5%脱脂奶粉，室温封闭 1 h；加入抗 α-SMA 抗体（1 ∶1 000 稀释）、抗COL1A1 抗体（1 ∶1 000 稀释）、抗 Fibronectin 抗体（1 ∶320 稀释）、抗 mTOR 抗体及抗 p-mTOR 抗体（均1 ∶1 000 稀释）、抗 S6 抗体及抗 p-S6 抗体（均 1 ∶1 000稀释）、抗 GAPDH 抗体（1 ∶1 000 稀释）、抗 β-actin抗体（1 ∶2 000 稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤 3次，加入HRP 标记的羊抗兔抗体、HRP 标记的马抗鼠抗体（均 1 ∶2 000 稀释），室温孵育 1 h；TBST 洗涤 3次，以 GAPDH 或 β-actin 为内参，用 ECL 试剂盒显影成像，凝胶成像仪进行曝光，统计条带灰度值后计算蛋白相对表达量。

1.8 统计学分析 应用Graphpad Prism 7.00 软件进行统计学分析。实验数据以均数± 标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠生长状态及肝脏大体形态 对照组小鼠8周内食欲及体重增长正常，反应灵敏，毛发光滑有光泽；肝脏表面光滑鲜艳，边缘锐利，为正常肝脏形态。4 周模型组4 周内食欲及体重增长速度下降，反应较灵敏，毛发出现分叉并变暗；肝脏外观色泽变暗，边缘钝化，但表面颗粒状病变不明显。8 周模型组的生存状态与4 周模型组小鼠较为一致，但从第4周后，其反应明显迟钝，精神萎靡且毛发蓬乱无光泽；肝脏外观色泽暗淡，边缘圆钝，表面和切面呈弥漫性的细小颗粒状。治疗组食欲及体重较8 周模型组有所改善，反应较为灵敏，毛发色泽与4 周模型组基本一致；肝脏形态与8 周模型组相比明显改善，但肝组织表面仍有细小颗粒。与对照组比较，8 周模型组及治疗组小鼠肝脏指数显著升高（T分别为5.496、3.022，P均 ＜ 0.05）。见图 1 和图 2。表明 Omega-3多不饱和脂肪酸饮食干预对纤维化小鼠的生长状态及肝脏形态有改善作用。造模开始时，各组小鼠平均体重均为23 g，在造模期间体重增长速度不同，但总体均呈上升的趋势，由于8 周模型组小鼠试验时间长于4 周模型组，该组平均体重高于4 周模型组。见表1。

图1 各组小鼠毛色状态及肝脏形态Fig.1 Hair colors and liver morphologies of mice in various groups

图2 各组小鼠肝脏指数Fig.2 Liver indexes of mice in various groups

表1 各组小鼠造模期间体重（g，，n = 5）Tab.1 Body weights of mice in various groups during modeling（g，，n = 5）

表1 各组小鼠造模期间体重（g，，n = 5）Tab.1 Body weights of mice in various groups during modeling（g，，n = 5）

组别 第4 周 第8 周对照组 27.744 ± 1.014 28.746 ± 0.884 4 周模型组 26.838 ± 0.514 -8 周模型组 26.830 ± 0.111 27.368 ± 0.731治疗组 26.848 ± 0.360 28.502 ± 0.322

2.2 小鼠肝组织的病理变化 结果显示，对照组小鼠肝细胞排列规则有序，以中央静脉为中心呈放射状，肝小叶结构完整清晰，未发现肝细胞坏死、脂肪变性及纤维组织增生现象，在汇管区出现少量胶原沉积，为正常肝脏病理形态；4 周模型组肝组织有少量肝细胞坏死及炎症细胞聚集，汇管区的胶原沉积增加，纤维组织出现少量增生，但其肝索、肝小叶及汇管区结构基本完整，为肝纤维化初始阶段；8 周模型组肝组织有广泛的肝细胞坏死及炎症细胞浸润，肝索排列紊乱无序，肝小叶结构被破坏，出现明显的纤维组织增生，并已形成假小叶，同时有大量的胶原沉积；与8 周模型组比较，治疗组小鼠肝组织结构损伤改善明显，汇管区或中央静脉间纤维间隔明显变薄，纤维组织增生及胶原沉积明显减少。与对照组比较，4 周模型组、8 周模型组及治疗组Masson 三色及天狼星红染色的肝组织阳性胶原面积百分比均显著增加（4 周模型组T分别为19.555 和44.424，8 周模型组T分别为 21.48 和 19.739，治疗组T分别为 44.598 和 21.712，P均 ＜ 0.01）；与 8 周模型组比较，治疗组Masson 三色及天狼星红染色阳性胶原面积百分比均显著降低（T分别为22.943 和22.885，P均 ＜ 0.01）。见图 3 和图 4。表明 Omega-3多不饱和脂肪酸饮食干预对CCl4诱导的肝纤维化小鼠有保护作用。

图3 各组小鼠肝组织HE、Masson 三色及天狼星红染色的显微镜观察（× 100）Fig.3 Microscopy of liver tissues of mice in various groups by HE，Masson trichrome and Sirius red staining（× 100）

图4 各组小鼠肝组织Masson 三色（A）及天狼星红染色（B）的阳性胶原面积百分比Fig.4 Percentage of collagen areas positive in Masson trichrome（A）and Sirius red（B）staining in mice of various groups

2.3 小鼠肝组织中α-SMA 蛋白的表达水平 与对照组比较，8 周模型组小鼠肝组织中α-SMA 蛋白表达水平显著升高（T= 41.924，P＜ 0.01）；与 8 周模型组比较，治疗组肝组织中α-SMA 蛋白表达水平显著下降（T= 36.278，P＜ 0.01）。见图 5 和图 6。表明Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预对HSC 的活化有抑制作用。

图5 各组小鼠肝组织中α-SMA 蛋白免疫组化染色的显微镜观察（× 200）Fig.5 Microscopy of α-SMA in liver tissue of mice in various groups by immunohistochemical staining（× 200）

图6 各组小鼠肝组织α-SMA 蛋白免疫组化染色的平均光密度值Fig.6 Mean optical density of immunohistochemical staining of α-SMA in liver tissues of mice in various groups

2.4 小鼠肝组织中 Bcl-2、Bcl-xL 及 PCNA 蛋白的表达水平 与对照组比较，8 周模型组小鼠肝组织中Bcl-2、Bcl-xL 及PCNA 蛋白表达水平均显著升高（T分别为 14.757、16.212 和 16.773，P均 ＜0.01）；与8 周模型组比较，治疗组肝组织中Bcl-2、Bcl-xL 及PCNA 蛋白表达水平均显著升高（T分别为 7.598、4.646 和 16.593，P均 ＜ 0.01）。见图 7 和图8。表明Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预可通过抑制肝细胞凋亡及促进肝细胞再生来发挥抗纤维化作用。

图7 各组小鼠肝组织中Bcl-2、Bcl-xL、PCNA 蛋白免疫组化染色的显微镜观察（× 200）Fig.7 Microscopy of Bcl-2，Bcl-xL and PCNA in liver tissues of mice in various groups by immunohistochemical staining（× 200）

图8 各组小鼠肝组织中 Bcl-2（A）、Bcl-xL（B）免疫组化染色的平均光密度值和PCNA（C）免疫组化染色的阳性细胞百分比Fig.8 Mean optical density of immunohistochemical staining of Bcl-2（A）and Bcl-xL（B）and percentage of PCNA positive cells（C）in liver tissue of mice in various groups

2.5 小鼠肝组织中Fibronectin、Collagen1A1 及α-SMA 蛋白的表达水平 与对照组比较，8 周模型组小鼠肝组织中 Fibronectin、Collagen1A1 及 α-SMA 蛋白表达水平均显著升高（T分别为18.216、41.173和 57.212，P均 ＜ 0.01）；与 8 周模型组比较，治疗组肝组织中 Fibronectin、Collagen1A1 及 α-SMA 蛋白表达水平均显著下降（T分别为12.317、28.991 和40.112，P均 ＜ 0.01）。见图 9 和图 10。提示 Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预可能通过抑制HSC 的活化进而减少促纤维化相关蛋白的表达。

图9 各组小鼠肝组织中 Fibronectin、Collagen1A1 及 α-SMA 蛋白表达水平的Western blot 检测Fig.9 Determination of expression levels of Fibronectin，Collagen1A1 and α-SMA in liver tissues of mice in various groups by Western blot

图10 各组小鼠肝组织中 Fibronectin（A）、Collagen1A1（B）及α-SMA（C）蛋白的表达水平Fig.10 Expression levels of Fibronectin（A），Collagen1A1（B）and α-SMA（C）in liver tissues of mice in various groups

2.6 小鼠肝组织中mTOR 及S6 蛋白的磷酸化水平与对照组比较，8 周模型组小鼠肝组织中mTOR 及S6蛋白的磷酸化水平均显著升高（T分别为11.141和18.464，P均 ＜ 0.01）；与 8 周模型组比较，治疗组肝组织中mTOR 及S6 蛋白的磷酸化水平均显著下降（T分别为 5.228 和 9.660，P均 ＜ 0.01），而 mTOR及S6 总蛋白的表达水平无变化（T分别为0.595和 0.589，P均 ＞ 0.05）。见图 11 和图 12。表明Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预对诱导的肝纤维化小鼠的保护作用与mTOR 信号通路有关。

图11 各组小鼠肝组织中 mTOR ／ p-mTOR 及 S6 ／ p-S6蛋白表达水平的Western blot 检测Fig.11 Determination of expression levels of mTOR ／ pmTOR and S6 ／ p-S6 protein in liver tissues of mice in various groups by Western blot

图12 各组小鼠肝组织中mTOR 及S6 蛋白的磷酸化水平Fig.12 Phosphorylation levels of mTOR and S6 protein in liver tissues of mice in various groups

3 讨 论

肝纤维化是机体对各种慢性肝损伤炎症刺激所引起的一种自我修复反应，是一切慢性肝病的共同病理学基础，阻止或减缓肝纤维化的发生及发展是预防肝硬化和肝癌发生的关键。目前临床主要采用类固醇物质、胆烷酸、内源性大麻素等化学药物进行肝纤维化治疗，这种治疗方式虽疗效确切，但存在副作用大及易耐药等问题，因此，迫切需要寻找一种作用温和、无毒性及无耐药性的新型抗纤维化疗法［15-18］。

Omega-3 多不饱和脂肪酸来源于深海鱼类，为一种安全和无耐药性的海洋生物活性化合物［19］，近年来，其对细胞生长及炎症的生物学作用已引起人们的重视。有研究表明，每日饮食补充4 g Omega-3多不饱和脂肪酸可有效降低重症创伤患者的全身炎症反应综合征发生率［20］。另一项对脓血症儿童的前瞻性、随机、双盲及对照试验发现，饮食补充Omega-3 多不饱和脂肪酸能显著降低患者C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、IL-6 及白蛋白等炎症指标的含量［21］。前期研究发现，Omega-3 多不饱和脂肪酸通过p38 MAP 激酶激活及周期蛋白D1 ／ CDK4 下调抑制内皮细胞的增殖［22］。因此，Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预相比传统抗纤维化药物治疗具有明显优势。本研究通过建立CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型，以mTOR 信号通路为切入点，在致病因素未去除，CCl4持续作用的条件下，探讨Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预的保肝作用及对mTOR 信号通路的影响。

肝纤维化发病机制可简单概括为4 步：致病因子、肝细胞损伤、炎症细胞浸润、HSC 活化。其中肝细胞损伤是肝纤维化起始阶段，主要表现为细胞水肿，损伤后的肝细胞会释放出大量刺激因子导致炎症细胞浸润，最终激活HSC［23-25］。激活的HSC 特异性表达平滑肌肌动蛋白（α-SMA），其活化后的结果导致ECM 的合成及降解失衡，以胶原纤维沉积最为直观，同时大量分泌α-SMA、Ⅰ型胶原（Collagen1A1）及纤维连接蛋白（Fibronectin），最终导致肝纤维化的形成［26］。本研究发现，与8 周模型组比较，Omega-3多不饱和脂肪酸饮食干预能明显减少肝细胞损伤及胶原纤维的沉积，其炎症水平和纤维化程度与4周模型组接近，且肝组织中HSC 活化的数量及其分泌的 α-SMA、Collagen1A1 及 Fibronectin 蛋白表达水平显著降低（P均 ＜ 0.01），表明 Omega-3 多不饱和脂肪酸能通过抑制HSC 的激活、降低促纤维化蛋白的表达发挥抗纤维化作用。

肝细胞作为肝脏的实质细胞，是肝纤维化发生时刺激因子的主要释放者。目前研究表明，正常肝组织中肝细胞凋亡及增殖并不活跃［27］，在肝纤维化的早期，机体启动肝脏代偿机制，可通过促进肝细胞的代偿性增殖进行自我修复，但在持续性肝损伤的情况下，肝细胞凋亡增加及增殖能力下降会促进肝纤维化的发展［27-29］。本研究发现，与对照组比较，8周模型组小鼠肝组织中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL 及细胞增殖蛋白PCNA 表达显著上调（P均 ＜0.01），表明肝脏发生了代偿性抗凋亡进行自我修复反应。与8 周模型组比较，治疗组小鼠肝组织中Bcl-2、BclxL 及PCNA 蛋白水平进一步显著升高（P均＜0.01），表明Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预可有效增强肝脏的自我修复能力。

mTOR 信号通路作为细胞生长中心协调器，可汇聚和整合来自营养、能量、生长因子及环境压力对细胞的刺激信号，通过下游效应器（4EBP1 及S6）调节细胞生长、增殖、分化及凋亡，对于肝纤维化的治疗具有重要意义［30-31］。有研究表明，mTOR 的过度激活是肝纤维化进展的一个重要信号转导通路机制之一［32-33］，与本研究结果相符，体现在8 周模型组小鼠肝细胞中mTOR 的磷酸化显著增加（P＜0.01），S6 蛋白的磷酸化水平大幅上调（P＜ 0.01），这些均为经典的mTOR 信号通路过度激活的象征。而在Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预的情况下，两组结果均显示对mTOR 通路的抑制。很多发表的文献中也不再展示对4EBP1 磷酸化的影响，一是相关商业化抗体的特异性一般不是很强，另外也不是所有体系中均会展示出对4EBP1 的调控。本研究发现，Omega-3 多不饱和脂肪酸能显著抑制肝脏组织中mTOR 及 S6 蛋白的磷酸化水平（P均 ＜ 0.01），提示Omega-3 多不饱和脂肪酸的抗纤维化作用与其对mTOR 信号通路的抑制有关。

综上所述，Omega-3 多不饱和脂肪酸饮食干预对CCl4诱导的肝纤维化小鼠有显著的保护作用，延缓了肝纤维化的发展，表明其可作为治疗肝纤维化潜在的新型方式之一；同时，Omega-3 多不饱和脂肪酸对mTOR 信号通路具有抑制作用，提示Omega-3多不饱和脂肪酸抗肝纤维化的作用机制与mTOR 信号通路有关。