马钱子碱治疗早期小鼠膝骨关节炎的作用机制研究*

向 杰，张海燕，李 多，朱明双

1.南充市中医医院(南充 637000)；2.成都中医药大学(成都 610072)；3.成都中医药大学附属医院(成都 610072)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是由力学和生物学等多种原因引起，以关节软骨退变和破坏为主要病理改变，且与年龄呈正相关的关节退行性疾病[1]。虽然KOA的病情进展缓慢，但早期若不对KOA病变进行干预，会导致膝关节功能紊乱，发生严重畸形，甚至导致残疾。据流行病学[2-3]报道，KOA已成为全球性的公共卫生问题，并随着社会老龄化发展该疾病发病率呈上升趋势。在美国<65岁人群中，约有1 400万人患有症状性KOA，而这其中有超过半数的患者为中晚期KOA[4]。此外，KOA引起的膝关节疼痛、畸形等症状还会增加心血管发生率和全因死亡率[5-6]。因此，缓解KOA疼痛等症状及延缓疾病进程对KOA患者具有重要意义。

马钱子是马钱科植物马钱的成熟干燥种子，古今医家对这味传统中药在骨关节炎的临床应用中积累了丰富经验，认为此药治疗骨关节炎效果良好。如娄多峰教授秉承治疗痹病应“以通为用”的学术观点，认为马钱子既可通痹止痛，又可与补虚药相伍，以扶正祛邪，标本兼治，实为治痹之要药[7-8]。王云川教授亦善运用马钱子治疗骨痹病，且疗效明显[9]。马钱子碱是从马钱子中提取的吲哚类生物碱，其发现约有200年历史[10]。研究[11]报道，马钱子碱是马钱子的主要有效成分，但它的毒性远低于马钱子，其在治疗骨关节炎疾病中展现出较大潜力。虽然已有研究[12-13]证实，马钱子碱治疗骨关节炎疗效确切，但其作用机制研究报道较少。因此，本研究拟通过构建KOA动物模型，观察马钱子碱对KOA模型小鼠软骨病变的影响，探讨马钱子碱治疗KOA小鼠的作用机制，为马钱子碱的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

10～12 周龄SPF 级的C57BL/6 雄性小鼠，体重(24±3)g，共24只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2017-204。

1.2 药物及试剂

马钱子碱(成都德思特生物技术有限公司)；番红-固绿染液(北京雷根生物科技有限公司)；二甲基亚砜(DMSO)(北京索莱宝科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶和磷酸化酶抑制剂混合物(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL试剂盒(美国Bio-Rad公司)；β-actin抗体(英国Abcam公司)；MTs、ZNT9ZIP8、MTF1抗体(美国Fisher公司)。

1.3 仪器

数码三目摄像显微镜BA400Digital(成都麦克奥迪有限公司)；高速冷冻离心机H1850R(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；微量核酸蛋白分析仪N50t(德国Implen公司)；荧光定量PCR仪CFX Connect、凝胶电泳仪PowerPacTM Basic(美国 BIO-RAD 公司)；全波长酶标仪MULTISKAN GO(美国Thermo Scientific公司)；图像分析软件Image-Pro Plus6.0(美国 Media Cybernetics公司)；全自动化学发光凝胶成像系统Champ Chemi 610(北京赛智创业科技有限公司)。

1.4 药物制备

马钱子碱溶液配置方法：首先用DMSO溶解马钱子碱，将其配制成98.6 g/L的储备液，-20 ℃储存备用(避光)。实验前用0.9%生理盐水稀释至所需浓度。

1.5 分组、造模及给药

采用内侧半月板失稳(destabilization of the medial meniscus，DMM)的方法建立KOA动物模型[14-16]。C57BL/6小鼠按照完全随机分组方法将其分为空白对照组和手术组，空白对照组6只，手术组18只，手术组采用DMM方法建立早期KOA动物模型。然后将手术组小鼠随机分为模型组、马钱子碱中剂量组、马钱子碱高剂量组，每组各6只。马钱子碱中剂量组：每天给予5 mg/kg马钱子碱溶液腹腔注射；马钱子碱高剂量组：每天给予10 mg/kg马钱子碱溶液腹腔注射；模型组：每天给予等体积的生理盐水腹腔注射；对照组：不采取任何干预措施。给药过程中密切观察小鼠情况，药物干预4周后采集标本。

1.6 样本采集及观察指标

1.6.1 样本采集 处死小鼠前禁食、不禁水12 h，次日上午称重，水合氯醛(0.05 mL/10 g)麻醉小鼠，用手术剪刀剪开小鼠右侧后膝关节皮肤，取小鼠右侧后膝关节软骨，锡箔纸包裹好，并置于液氮中保存，用于后续实验。

1.6.2 免疫荧光染色技术检测4组小鼠软骨组织内Zn2+表达 取小鼠胫骨平台内侧软骨组织制备10 μm冰冻切片，置于 PBS 溶液中洗涤，在一抗(Zn2+)、二抗溶液中完成孵育后，利用荧光显微镜观察细胞内 Zn2+表达。

1.6.3 RT-qPCR检测4组小鼠软骨组织内的ZIP8、ZNT9、MTF1、Mt1、Mt2基因表达 用液氮将小鼠软骨组织研磨成粉末状，提取RNA，检测RNA溶度，采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量，β-actin作为归一化内参基因。PCR引物序列见下表，引物由上海生工生物合成(表1)。

表1 PCR引物序列

1.6.4 蛋白质印迹技术检测4组小鼠软骨ZIP8、ZNT9、MTF1、Mts蛋白表达 用液氮将小鼠关节软骨进行充分研磨，加入RIPA裂解液，冰上匀浆，应用高速冷冻离心机对样本进行处理，转速12 000 r/min，离心半径15 cm，时间5 min，收集上清液。应用BCA法检测软骨总蛋白浓度。各孔取20 μg蛋白上样，200 V电泳进行蛋白分离，PVDF膜100 V湿转。用ZIP8、ZNT9、MTF1、Mts一抗孵育，封闭过夜。二抗室温孵育2 h。交替使用TBST和TBS洗涤PVDF膜2次，10 min/次。按ECL试剂盒说明进行显影拍摄。用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析目的蛋白的光密度值(IOD)。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度马钱子碱对软骨细胞内Zn2+表达的影响

免疫荧光染色结果显示，与空白对照组相比，模型组软骨细胞内Zn2+表达明显增加，经马钱子碱药物干预后，马钱子碱高、中剂量组小鼠软骨细胞内Zn2+表达明显降低，且马钱子碱高剂量组表达更低(图1)。

图1 不同浓度的马钱子碱对软骨细胞内Zn2+表达的影响

2.2 4组小鼠关节软骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MT1、MT2 mRNA表达比较

与空白对照组相比，模型组的ZIP8、MTF1 mRNA相对表达量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，ZNT9、MT1、MT2 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，马钱子碱高剂量组和马钱子碱中剂量组ZIP8、MTF1 mRNA相对表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，ZNT9、MT1、MT2 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。马钱子碱高剂量组和马钱子碱中剂量组ZIP8、MTF1相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 4组小鼠关节软骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MT1、MT2 mRNA表达比较

2.3 4组小鼠关节软骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表达量比较

与空白对照组相比较，模型组的ZIP8、MTF1、ZNT9蛋白相对表达量明显增加(P<0.05)。空白对照组和模型组MTs蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比，马钱子碱高剂量组和中剂量组ZIP8、MTF1蛋白表达量降低(P<0.05)，ZNT9、MTs蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。马钱子碱高剂量组ZIP8蛋白表达量高于马钱子碱中剂量组(P<0.05)。马钱子碱高剂量组和马钱子碱中剂量组MTF1、ZNT9、MTs蛋白表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图2、表3)。

图2 4组小鼠关节软骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表达

表3 4组小鼠关节软骨ZIP8、ZNT9、MTF1、MTs蛋白表达量比较

3 讨论

在临床实践中，含有马钱子的中药成方，例如痹祺胶囊、九分散及腰痛宁等在骨关节炎的治疗中疗效明显[17-18]。研究[11-12]发现，马钱子碱具有抗肿瘤、抗心律失常、抗骨关节炎的作用，在骨关节炎作用尤为突出。马钱子碱可明显抑制软骨细胞凋亡[19]，促进体外培养的人软骨细胞增殖[20]。

研究[21-23]发现，Zinc-ZIP8-MTF1信号通路在KOA软骨退变中发挥了重要作用。当关节软骨遭受到机械压力损伤、炎性因子刺激等伤害时，Zn2+转运蛋白ZIP8表达水平明显增加，介导细胞外Zn2+大量内流；而随着细胞内Zn2+水平增加，Zinc-ZIP8-MTF1信号通路下游转录因子MTF1被激活，活化的MTF1促进软骨细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)表达，激活分解代谢级联反应，介导KOA软骨病变[21-23]。

近年来研究[24-25]发现，Zn2+与骨关节炎关系密切。研究[25-26]发现，在骨关节炎患者的血液和尿液中Zn2+高表达，Zn2+可作为KOA早期诊断指标。此外，研究[27]发现，Zn2+在老年人的关节软骨潮线区有特异性积累。Zn2+是人体重要的微量元素，它在细胞水平始终处于动态平衡，当这种动态平衡被打破时，人体容易出现胚胎发育异常、免疫功能低下及肿瘤等多种疾病[28-30]。因此，维持Zn2+的稳态对保持细胞正常功能和机体健康具有重要意义。

Zn2+的稳态调节主要受ZNT家族、ZIP家族、MTs及MTF1等蛋白调控[29，31]。ZNT家族主要把Zn2+从细胞内转运到细胞外，负责Zn2+流出。ZIP家族主要是把Zn2+转运到细胞内，其中与骨关节炎密切相关的是ZNT9和ZIP8。MTs主要储存Zn2+，调节Zn2+表达[21]。MTF1的主要特征是激活MTs，并且在调节细胞内Zn2+水平方面具有重要作用[21，28]。本研究探讨了马钱子碱对ZIP8、ZNT9、MTF1、MTS 基因和蛋白的影响。结果发现，空白对照组中Zn2+未见表达，而模型组软骨细胞内Zn2+表达明显增加；经马钱子碱药物干预后，马钱子碱高、中剂量组小鼠软骨细胞内Zn2+表达明显降低，且马钱子碱高剂量组Zn2+表达更低。同时，与空白对照组比较，模型组ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白相对表达量明显增加(P<0.05)。与模型组相比较，马钱子碱高、中剂量组ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05)。

综上所述，本研究发现马钱子碱可通过降低KOA小鼠ZIP8、MTF1 mRNA和蛋白表达，调控软骨细胞内Zn2+表达，达到延缓早期KOA模型小鼠软骨退变的作用机制。但本研究样本不足，还需扩大样本进行进一步验证，且本研究是以动物实验为基础，未来对马钱子碱防治KOA的作用机制还需更多临床研究。