清酒乳杆菌对臭鳜鱼食用品质及挥发性风味物质的影响

周迎芹，杨明柳，殷俊峰，鄢 嫣，林心萍，谢宁宁*

（1 安徽省农业科学院农产品加工研究所 合肥230031 2 安徽省食品微生物发酵与功能应用工程实验室 合肥230031 3 浙江海洋大学食品与医药学院 浙江舟山316022 4 大连工业大学国家海洋食品工程技术研究中心 辽宁大连116034）

鳜鱼（Siniperca chuatsi），俗称桂花鱼，属鲈形目、鮨科、鳜亚科、鳜属[1]，是广泛分布于我国各主要江河湖泊的名贵食用鱼类，肉质细嫩、味道鲜美，营养价值高[2-3]。以鳜鱼为原料加工的传统发酵食品——黄山臭鳜鱼，在保留鳜鱼鲜美味道的同时，新增了独具似臭非臭、香鲜透骨、Q 弹嫩滑的特殊口感和风味，深受人们喜爱[4-5]。

近年来，在安徽黄山地区，臭鳜鱼产业规模不断扩大。据统计，截止至2018年10月，黄山臭鳜鱼加工企业达40 余家，年总产值超过10 亿元，对当地经济发展和促进工人增收具有重要意义。目前臭鳜鱼加工工艺仍沿用落后的传统自然发酵方式，加工过程更多依靠生产者的经验判断，发酵产品稳定性差，产品风味品质参差不齐[6]，很大程度上制约了臭鳜鱼产业的发展。乳酸菌接种发酵是一种改善发酵食品品质的优良方法[7]，在各类食品，如乳制品[8-9]、泡菜[10-11]、果蔬汁饮料[12-13]、调味品[14]、豆制品[15]、肉制品[16]等中有广泛应用。将乳酸菌发酵剂用于臭鳜鱼腌制，有望使臭鳜鱼的品质得到改善。

有研究发现，清酒乳杆菌是臭鳜鱼发酵过程中的优势微生物之一[17-18]，而其对臭鳜鱼食用品质、风味特征等的影响尚未见报道。腌制发酵赋予臭鳜鱼典型的品质特征，即鱼肉片片如蒜瓣，呈闻臭吃香的特殊风味。本试验采用清酒乳杆菌接种发酵臭鳜鱼，以自然发酵作为对照，研究菌株对臭鳜鱼发酵过程中特征蒜瓣肉的变化以及对质构、色泽和挥发性风味物质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鳜鱼（秋浦花鳜），东至县大联圩有限公司，质量规格为0.5～0.6 kg。食用钠盐、花椒，合肥市庐阳区中菜市。氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇等常规化学试剂（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司。气相色谱-离子迁移谱测试用标准品，美国Sigma-Aldrich 公司。清酒乳杆菌，从丹麦科汉森B-2 发酵剂中活化培养获得。

1.2 仪器与设备

臭鳜鱼腌制发酵专用装置，本实验室自行设计[19]；CR-400 色差分析仪，柯尼卡美能达控股公司；TA.XT Plus 质构仪，英国Stable Micro System 公司；FlavourSpecR气相色谱-离子迁移谱联用仪，德国G.A.S.公司。

1.3 方法

1.3.1 鳜鱼腌制发酵 腌制发酵工艺：新鲜鳜鱼宰杀→清洗→码放→腌制→发酵→真空包装→贮藏

自然发酵：选择0.5～0.6 kg 的标准鳜鱼作为腌制原料，宰杀去内脏、鳃和鳞，用自来水和10%盐水先后清洗1 次，待用。将鱼平整码放于鳜鱼发酵专用装置内，一桶约码放30 kg，每码一层，撒若干粒炒制花椒（15 g），码放结束后在上层鱼体上放置按压板，并向桶内加入提前配制好的腌制液（11 kg 的8%盐水），按压板上放置扁圆状砝码（12 kg），用以将鱼体全部浸压于腌制液液面以下。合上发酵装置顶盖，以厌氧发酵方式，于8 ℃条件下发酵16 d，按发酵0，0.5，1，2，4，6，8，10，12，14，16 d 取样，每个阶段各取4 条鱼，真空包装贮藏于-18 ℃冰箱，备用。

接种发酵：除腌制液为8%盐水（11 kg）和清酒乳杆菌37.5 g（按菌体湿重计）的混合液外，其它步骤同自然发酵方法。

1.3.2 特征蒜瓣肉观察 取各阶段样品鱼1 条，解冻，用解剖刀沿鱼的脊背和鳃盖后沿将两侧鱼皮划裂，轻轻剥离至尾部，切取同侧的、沿背鳍下方至侧线之间的肌肉块。将肌肉块放入蒸锅中隔水蒸煮10 min，取出，室温下冷却后剥离蒜瓣肉，肉眼观察并拍照。

1.3.3 色泽和质构测定 取各阶段样品鱼3 条，解冻，并用解剖刀沿脊背和鳃盖后沿将两侧鱼皮划裂，并轻轻剥离至鱼尾，切取鱼体全部肌肉并用料理机绞成鱼肉糜，分别将各阶段3 条鱼的肉糜合并，搅拌均匀，取200 g 鱼肉糜灌入聚乙烯塑料肠衣中（25 mm），打卡封口，鱼肉肠长度均为10 cm。将灌制好的鱼肉肠放入蒸锅蒸煮10 min，待取出，冷却至室温后测定鱼肉色泽和质构。

色泽和质构的测定参照本实验室前期建立的方法进行[20]，色泽测定指标包括亮度（L*）、红度（a*）和黄度（b*），利用L*、a*和b*值按公式（1）计算样品白度[21]。

质构测定指标包括硬度、黏附性、弹性、胶黏性和咀嚼性。色泽和质构各参数测定值均以平均值表示。

1.3.4 挥发性风味物质测定 利用气相色谱-离子迁移谱仪，并依据本实验室前期建立的方法步骤测定鱼肉挥发性风味物质[20]。按1.3.3 节步骤制作肉糜，准确称取各阶段鱼肉糜1 g，分别置于20 mL 顶空进样瓶中，拧紧瓶盖，放入GC-IMS 顶空进样器上（每个阶段设置3 个平行样品）。

顶空进样条件：孵化温度40 ℃，孵化时间20 min，进样针温度85 ℃，进样体积500 μL，振动速度500 r/min。

色谱条件：色谱柱为FS-SE-54-CB-0.5 15 mm，ID：0.53 mm，色谱柱温度40 ℃，分析时间40 min。载气为高纯N2，流速设置：0～2 min（2 mL/min），2～10 min（2～15 mL/min），10～20 min（15～80 mL/min），20～25 min（100～130 mL/min），25～40 min（130～145 mL/min）。

离子迁移谱条件：漂移气为高纯N2，流速150 mL/min，IMS 探测器温度45 ℃。

GC-IMS 在正离子模式下通过有线网络将数据传输并保存到计算机中，每张谱图平均扫描32次，使用网格脉冲宽度为100 μs，重复率为21 ms，采样频率为150 kHz。采用仪器内置的LAV软件（Laboratory Analytical Viewer）、GC-IMS Library Search Software 软件对样品进行挥发性物质的指纹图谱分析和物质定性分析。

1.4 数据处理

试验数据均采用Excel 进行整理和计算，并用Origin 2017 软件作图。

2 结果与分析

2.1 清酒乳杆菌接种发酵对臭鳜鱼特征蒜瓣肉的影响

腌制发酵而成的臭鳜鱼，其典型的品质特征就是鱼肉呈蒜瓣状。沿背鳍下方至侧线之间的肌肉，其蒜瓣状尤为明显。蒸煮后通过剥离可以发现，臭鳜鱼的蒜瓣状肉质是在腌制发酵过程中逐渐形成的（图1 和图2）。发酵初期开始形成蒜瓣状，至中后期时，鱼肉逐渐变白，蒜瓣状也逐渐明显。接种清酒乳杆菌进行发酵后，鱼肉的蒜瓣状在发酵0.5 d 即初步形成，较自然发酵更早出现，整个发酵过程的蒜瓣状比自然发酵更规则，鱼肉也更白亮。

图1 自然发酵（a）和接种发酵（b）过程中特征蒜瓣的变化Fig.1 Changes of characteristic garlic clove during natural fermentation（a）and inoculated fermentation（b）

2.2 清酒乳杆菌接种发酵对臭鳜鱼色泽和质构的影响

在自然、接种发酵过程中，鱼肉亮度L*在发酵2 d 内逐渐增强，发酵2～16 d 时呈缓慢减弱趋势（图2a），a*值和b*值在发酵过程中呈逐渐降低趋势（图2b、2c），鱼肉白度变化趋势同亮度变化趋势（图2d）。发酵过程中3 个指标的综合变化，使鱼肉白度得到提升（图3）。总体来说，清酒乳杆菌接种发酵能够改善臭鳜鱼鱼肉色泽。

图2 自然、接种发酵过程中色泽的变化Fig.2 Changes of color during natural fermentation and inoculated fermentation

图3 自然、接种发酵臭鳜鱼成品色泽的比较Fig.3 Comparison of color of stinky mandarin fish by natural fermentation and inoculated fermentation

在自然、接种发酵过程中，鱼肉质构变化均较为明显，其中硬度、胶黏性和咀嚼性的变化趋势基本一致，即呈先降低后增加趋势，黏附性在发酵刚开始即有显著变化，在0.5 d 时达最大值，0.5 d 后保持恒定，弹性指标从发酵开始至发酵结束逐渐增加，在发酵4 d 内增加趋势较为明显，发酵中后期则无明显增加趋势。总体来说，鳜鱼在发酵后硬度降低，其它参数值均增加（图5）。接种发酵臭鳜鱼成品与自然发酵臭鳜鱼成品相比，硬度降低，弹性、黏附性、胶黏性和咀嚼性增加，表明接种发酵后，质构指标的综合变化使臭鳜鱼鱼肉更为Q 弹。

图4 自然、接种发酵过程中质构的变化Fig.4 Changes of texture during natural fermentation and inoculated fermentation

图5 自然、接种发酵臭鳜鱼成品质构的比较Fig.5 Comparison of the texture of stinky mandarin fish by natural fermentation and inoculated fermentation

2.3 清酒乳杆菌接种发酵对臭鳜鱼挥发性风味物质的影响

通过GC-IMS 对臭鳜鱼在自然、接种发酵过程中的挥发性风味物质进行检测和分析，共鉴定出36 种挥发性风味物质（表1），其中醇类11 种、酮类8 种、醛类5 种、酯类5 种、酸类2 种、醚类3种、烯烃类2 种。

表1 臭鳜鱼发酵过程中的挥发性风味物质Table 1 The volatile flavor components during fermentation of stinky mandarin fish

利用GC-IMS 仪器内置的LAV 软件将样品挥发性风味物质的特征信号峰生成指纹图谱（图6）。在图谱中，每纵列特征信号峰对应一种挥发性风味物质，信号峰上颜色由白到黑表示物质浓度由低到高。新鲜鳜鱼主要含有甲硫醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、壬醛、苯甲醛、甲硫基丙醛、3-戊酮、2，3-戊二酮、甲乙酮、丙酸乙酯和乙酸己酯等挥发性风味物质，一经腌制发酵，其挥发性风味物质及含量随着发酵过程的进行在不断变化。自然发酵初期（图6a），0.5～2 d 内所含挥发性风味物质种类较少，且比新鲜鳜鱼中的挥发性风味物质种类更少，发酵至2 d 时挥发性风味物质种类开始增加，主要包括乙酸己酯；发酵2～8 d，新增较多挥发性风味物质种类，主要包括芳樟醇、4-甲基-2-戊酮、3-辛酮、乙酸乙酯、己酸和柠檬烯等；8～16 d，较少产生新物质，鱼肉中5-甲基-2-呋喃甲醇、丙醇等含量明显增加，异丁醇、羟基丙酮、乙酸乙酯、丁酸乙酯等含量明显降低。与自然发酵相比，清酒乳杆菌接种发酵对臭鳜鱼风味品质具有明显影响（图6b）。对比发酵成熟臭鳜鱼的GC-IMS 指纹图谱（图7）来看，自然、接种发酵臭鳜鱼成品的挥发性风味物质存在差异。接种清酒乳杆菌发酵臭鳜鱼中，丁酸乙酯、乙酸己酯、羟基丙酮、2，3-丁二醇、玫瑰醚、甲硫醇、2，3-戊二酮、甲硫基丙醛、2-辛醇、丙醇和4-甲基-2-戊酮等的含量明显低于自然发酵臭鳜鱼，而芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯、柠檬烯等挥发性香气物质的含量比自然发酵臭鳜鱼明显增加，表明清酒乳杆菌接种发酵臭鳜鱼，能够降低鱼肉中甲硫醇等恶臭气味的产生和促进芳樟醇等香气物质的生成。

图6 自然发酵（a）和接种发酵（b）过程中挥发性风味物质的变化Fig.6 Changes of volatile flavor during natural fermentation（a）and inoculated fermentation（b）

图7 自然、接种发酵臭鳜鱼成品中挥发性风味物质组成Fig.7 Volatile flavor constituents in finished products of stinky mandarin fish by natural fermentation（a）and inoculated fermentation（b）

（续表1）

清酒乳杆菌具快速产酸、产细菌素和抑制杂菌生长的能力[22]，在接种发酵臭鳜鱼时，可能是通过改变菌群结构，抑制产臭微生物生长和减少细菌种类、数量，形成优于自然发酵臭鳜鱼的风味。芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和柠檬烯均为香辛料中挥发性物质，赋予臭鳜鱼具有植物花香的风味特征，是在腌制发酵过程中由添加的花椒所带入[23]。在植物花椒中，这些物质也是其本身主要的挥发性物质[24]。随着腌制发酵过程的进行，花椒中的挥发性物质经渗透作用逐渐进入鱼体，构成鱼肉重要的风味物质。清酒乳杆菌接种发酵后，可能有利于花椒中的挥发性物质渗入至发酵液中。在臭鳜鱼风味研究中，芳樟醇是臭鳜鱼中常见的挥发性风味物质[25-27]，且被认为是对臭鳜鱼整体风味品质具有重要贡献的风味活性物质[26-27]。在本研究中，清酒乳杆菌的接入，使臭鳜鱼中芳樟醇等香气物质得到更多积累，对产品风味具有提升作用。

3 结论

本研究通过对比自然发酵和清酒乳杆菌接种发酵臭鳜鱼发酵过程中特征蒜瓣、色泽、质构等食用品质和挥发性风味物质的变化情况，发现清酒乳杆菌接种发酵能使臭鳜鱼在发酵过程中的特征蒜瓣形成提前，且蒜瓣肉更规则；接种发酵组臭鳜鱼的色泽，包括亮度和白度均优于自然发酵组臭鳜鱼，鱼肉硬度低于自然发酵组，且弹性、黏附性、胶黏性和咀嚼性均高于自然发酵组；从挥发性风味物质检测结果来看，自然、接种发酵过程中的挥发性物质均在不断地变化，清酒乳杆菌接种发酵对臭鳜鱼风味物质形成具有明显影响，发酵成品中产恶臭味的甲硫醇含量明显减少，带有植物花香的物质，包括芳樟醇、α-松油醇、α-蒎烯和柠檬烯等的含量明显增加，对产品风味具有提升作用。