山西老陈醋优良芽孢菌与醋酸菌、乳酸菌的相互作用

贾瑞娟，陈旭峰，胡开燕，郭宏萍，许 女*

（1 山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801 2 黄土高原特色作物优质高效生产省部共建协同创新中心 山西太谷030801）

作为中国“四大名醋”之一的山西老陈醋，其采用传统自然固体发酵并结合独特熏、淋、晒等工艺，形成老陈醋独特的酸、绵、香、甜风味与口感[1]。老陈醋的独特风味得益于微生物菌群的生长和代谢以及复杂的协同作用，产生丰富的香味物质，除霉菌、酵母菌、乳酸菌、醋酸菌外，芽孢菌也是山西老陈醋发酵生产过程中的重要微生物种群，它在老陈醋风味和功能成分的形成中起到重要作用[2]。

芽孢杆菌是一类数量众多的细菌，需氧或兼性厌氧，杆状，革兰氏阳性，能够在某些条件下形成内生孢子[3]。国内外关于芽孢杆菌的研究已有多年历史，对于芽孢杆菌的形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘以及生物防治等方面的研究已相当透彻[4]。2016年，王进龙[5]从山西老陈醋中分离出的芽孢菌有：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、萎缩芽孢杆菌（Bacillusatrophaeus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。

芽孢菌在陈醋酿造中起着重要的作用。乙偶姻是山西老陈醋重要功能成分川穹嗪的前体物质[6]，而芽孢菌产乙偶姻的能力比乳酸菌、醋酸菌更强、更稳定[7]。国内外相关产乙偶姻菌种的筛选、育种、发酵工作也大都集中于芽孢菌。2015年，高文睿等[8]从凉州熏醋中筛选出高产乙偶姻的芽孢菌Y4，产量为2.376 mg/mL；2013年，张显[9]采用传统诱变方法对枯草芽孢杆菌JNA 3-10 进行复合诱变，获得1 株2，3-丁二醇脱氢酶（BDH）缺失型乙偶姻高产突变株JNA-UD-6，消耗150 g/L 葡萄糖，得到53.9 g/L 的乙偶姻和6.5 g/L 的2，3-丁二醇；2017年，Li 等[10]通过改变2，3-丁二醇的转化策略，提高了地衣芽孢杆菌乙偶姻的产量。芽孢菌在陈醋中除对产乙偶姻有重要贡献外，还产生多酚类物质，从而赋予山西老陈醋抗氧化的功能[11]。2014年，郇阿梅等[12]从四川传统麸醋醋醅中筛选出1 株芽孢菌YB-32，培养24 h 后产生的总酚含量为263.6 μg/mL。另外，芽孢菌还可产不挥发性酸，缓解山西老陈醋中乙酸的强烈刺激性酸味，使醋的口感更柔和醇厚[13]。芽孢菌的代谢产物与发酵体系中的其它物质发生反应，生成一些风味物质，如乳酸乙酯、乙酸乙酯、柠檬酸乙酯、二羟基丙酮等，这些物质可以很好地改善食醋风味[14]。在白酒产业中，关于产香芽孢菌的筛选和应用积累了大量的研究资料，而在陈醋研究中鲜有关于产香芽孢菌的筛选和应用方面的报道。

醋酸菌和乳酸菌是山西老陈醋醋酸发酵阶段的优势细菌菌群。醋酸菌是陈醋醋酸发酵过程中的主要菌种，可以通过乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶催化反应将醇代谢为酸。目前，陈醋酿造中常用的醋酸菌有奥尔兰醋杆菌（Acetobacter orleanense）、许氏醋杆菌（Acetobacter schuegenbachii）、弯曲醋杆菌（Acetobacter curvum）、纹膜醋杆菌（Acetobacter aceti）、恶臭醋酸杆菌（Acetobacter rancens）、攀膜醋杆菌（Acetobacter ascendans）、胶膜醋杆菌（Acetobacter xylinum）等。醋酸菌在酿醋过程中除产酸外，还产乙偶姻（川穹嗪前体物质）等功能性物质。Dai 等[15]报道了1 株汉氏醋杆菌（acetobacter hansenii）产乙偶姻量达8.93 g/L。在醋酸发酵阶段中除醋酸菌产酸外，乳酸菌也可产生乳酸等不挥发性酸，减缓由总酸含量引起的刺激味道，使酸味更柔和、醇厚。此外，乳酸菌产生的乳酸及其它不挥发性酸与醇类物质生成乳酸乙酯等各种酯类物质，也可丰富山西老陈醋的风味和香气。

微生物之间的互相作用可以增加其代谢物和功能物质的含量。关于芽孢菌间的互作研究主要集中在白酒大曲的强化。2011年，杨涛等[16]将5 株嗜热芽孢杆菌、3 株酵母菌及1 组复合产酸菌应用于酱香白酒生产中，使得香味基酒的比例增加，并且白酒中的己酸和己酸乙酯含量也显著提高；2017年，庄孝杰等[17]从酱香型酒醅中筛选出具有优良特性的拜耳接合酵母，研究其与地衣芽孢杆菌的互作，结果表明地衣芽孢杆菌促进了拜耳接合酵母的乙醇转化率，共培养体系中风味物质的种类和含量也受到很大影响。2015年，吉晋波[18]对分离自镇江香醋醋醅的8 株乳酸菌及2 株醋酸菌的相互作用进行了研究，结果表明醋醅中醋酸菌与乳酸菌稳定共存，并对比分析了二者纯培养及共培养发酵液中风味化合物的差异。

本文从山西老陈醋酿造过程中分离的54 株芽孢菌中，筛选出2 株发酵性状优良的芽孢杆菌菌株，研究了这两株芽孢菌之间，及与醋酸菌和乳酸菌间的相互作用，考察了其在纯培养和不同比例共培养条件下对生物量、乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸、有机酸和挥发性香气成分的影响，为将来进一步开发山西老陈醋酿造复配直投式发酵剂进行了重要的基础研究和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 醋醅取自醋厂醋酸发酵0，1，3，5，7，9，11 d 的醋醅。

巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19 为实验室前期筛选的优势优良菌株，保存至山西农业大学食品与工程学院生物工程实验室。

1.1.2 培养基与试剂 MRS 培养基，青岛高科园海博生物科技有限公司；模拟醋醅培养基，山西老陈醋醋厂醋酸发酵第2 天的醋醅，即为模拟醋醅培养基；醋酸菌培养基：酵母10 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，灭菌后加4%无水乙醇。

细菌DNA 提取试剂盒，北京博迈德基因科技有限公司；PCR 引物，由深圳华大基因公司合成；Maker D、MIX，上海生工生物工程有限公司；福林试剂、肌酸（均为分析纯），北京索莱宝科技有限公司；草酸、丙酮酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯），天津市光复精细化工研究所。

1.2 主要仪器、设备

T100 型PCR 仪、Universial Hood Ⅱ型凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司；DYY-6C 型琼脂糖凝胶电泳仪，北京六一仪器厂；722 型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；戴安U3000 液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；Trace1300气相色谱仪，TraceISQ 质谱分析仪；5417R 型高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山西老陈醋源芽孢菌的分离和鉴定 在无菌、常温条件下，将25 g 样品加入内置玻璃珠的225 mL 无菌生理盐水中，140 r/min 振荡培养20 min，使其混匀；然后梯度稀释，选取10-5，10-6，10-73 个梯度，涂布于MRS 琼脂平板培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养1～2 d。选取菌落数在30～300的平板，挑取其上表面粗糙、菌落形态较大的单个菌落涂片和革兰氏染色，在电子显微镜（1 000×）下观察菌株细胞形态和拍照。对镜检结果为革兰氏阳性、有芽孢的杆状菌株用试剂盒提取其基因组，16S rDNA 测序比对，并用MEGA5.1 软件构建系统进化树。应用的引物如下：上游：5′-CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG -3′ ；下 游 ：5′ -CGACTTCACCCAATCATCTG-3′。将鉴定结果为芽孢菌的，反复划线于MRS 平板培养基，37 ℃培养，直至获得纯化的菌株，对其菌落拍照。

1.3.2 山西老陈醋源优良芽孢菌的筛选 将54株已鉴定的芽孢菌接种于MRS 液体培养基中，37℃恒温培养24 h 后，取菌株发酵液3 mL，参照文献[19]、[20]测定总酯含量及不挥发性酸含量。将发酵液8 000 r/min 离心10 min，取上清液1 mL，采用福林-酚比色法测定多酚含量[21]。取上清液3 mL，采用O'Meara-比色法测定乙偶姻含量[22]。

1.3.3 解淀粉芽孢杆菌1539 与枯草芽孢杆菌803 的相互作用研究 将筛选出的优良芽孢菌株解淀粉芽孢杆菌1539 与枯草芽孢杆菌803 分别接种于MRS 液体培养基中，37 ℃培养24 h，菌体浓度均达到1×106CFU/mL 时，分别按照解淀粉芽孢杆菌1539 与枯草芽孢杆菌803 接种比例为1∶0，0∶1，1∶0.1，1∶0.5，1∶1，1∶5，1∶10（V/V）[23]，总接种量为2%，加入30 g 醋醅模拟培养基，37 ℃静置培养6 d。

1）生物量的测定 采用MRS 培养基稀释平板菌落法测定解淀粉芽孢杆菌1539 与枯草芽孢杆菌803 的生物量。

2）乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸含量的测定 取10 g 上述培养6 d 的样品，加入90 mL 蒸馏水浸泡30 min，4 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用上述1.3.2 节方法，测定纯培养和共培养体系中芽孢菌的乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸含量。

3）有机酸含量的测定 取5 g 上述培养6 d的样品，用超纯水定容50 mL，12 000 r/min 离心5 min，取上清液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，采用外标法测定草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸等8 种有机酸的含量，用HemI 和Simca 软件绘制有机酸的Heatmap 图和PCA 图。色谱测定条件为：液相系统UItimate 3000；色谱柱C18 4.6 mm×150 mm，5 μm；流动相20 mmol/L NaH2PO4，pH 2.7；进样量20 μL；流动速度0.8 mL/min；检测器UV210 nm；柱温：室温。

4）挥发性香气种类和含量的测定 采用顶空固相微萃取方法[24]萃取上述培养6 d 的1 g 样品，用直接内标法测定其挥发性香气的种类和含量，用HemI 和Simca 软件绘制挥发性香气的Heatmap 图和PCA 图。色谱条件：色谱柱为VF-5MS（30 mm×0.25×0.25 mm），载气为氦气（纯度99.999%），流量1 mL/min，不分流。程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min，以4 ℃的速度升至160℃，保持1 min，再以10 ℃/min 的速度升至270 ℃保持5 min。质谱条件：接口温度280 ℃，离子源温度280 ℃，电子能量70 eV，扫描质量范围41～500 amu。

1.3.4 醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌共培养的相互作用研究

1）菌体培养 将巴氏醋杆菌33 接种于醋酸菌液体培养基，30 ℃培养48 h 后菌体浓度达1×106CFU/mL，备用。将植物乳杆菌19 接种于MRS液体培养基，37 ℃培养24 h，菌体浓度达1×108CFU/mL，备用。

2）醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌的共培养 根据上述1.3.3 节方法将解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 按1∶10（V/V）混合，再和巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19 等比例进行不同组合的共培养，总接种量为2%，在30 g 醋醅模拟培养基中30 ℃静置培养6 d。

3）生物量、挥发性香气种类和含量测定 用MRS 培养基稀释平板菌落法测定植物乳杆菌19、解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 的生物量，醋酸菌培养基稀释平板菌落法测定巴氏醋杆菌33 的生物量。采用1.3.3 节方法，测定纯培养和共培养体系中的挥发性香气种类和含量。

2 结果与讨论

2.1 山西老陈醋源芽孢菌的分离、鉴定结果

经形态学观察和16S rDNA 测序比对，共分离得到54 株芽孢菌。由图1 可知，54 株芽孢菌中有17 株解淀粉芽孢杆菌，14 株枯草芽孢杆菌，11株地衣芽孢杆菌，1 株莫海威芽孢杆菌，2 株短小芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、龙舌兰杆菌和沙福芽孢杆菌，其中解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均为山西老陈醋醋酸发酵阶段的优势芽孢菌，分别占芽孢菌的31.36%，26.26%，20.59%。通过构建系统进化树（图2）可知，解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌、甲基营养型芽孢杆菌的亲源性关系较近，而与地衣芽孢杆菌的亲源性关系更近，达99%，另外，短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌聚类在另一个分支。典型芽孢菌的菌落形态和细胞形态描述见表1。

表1 山西老陈醋典型芽孢菌菌落和细胞形态的描述Table 1 The colony and the cell morphology of typical bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

图1 山西老陈醋醋醅中分离的芽孢菌种百分含量的饼状图Fig.1 Pie chart of the percentage of bacillus species isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

图2 基于16S rDNA 的山西老陈醋典型芽孢菌的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of typical bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar based on the 16S rDNA sequences

图3 山西老陈醋典型芽孢菌的菌落和细胞形态图Fig.3 The colony and cell morphology of typical bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

2.2 山西老陈醋源优良芽孢菌的筛选

从醋醅中分离纯化得到54 株芽孢菌菌株，测定芽孢菌发酵液的乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸能力。各能力均较高的10 株芽孢菌的乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸含量如图4所示，其中枯草芽孢杆菌803 产乙偶姻、总酯含量最高，解淀粉芽孢杆菌1539 产多酚、不挥发酸含量最高。

乙偶姻是山西老陈醋重要功能成分川穹嗪的前体物质，为了提高陈醋中川穹嗪含量，一些学者对产乙偶姻的菌株进行筛选，包括酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和芽孢菌。国内外产乙偶姻菌种的筛选、育种、发酵也大都集中于芽孢菌。枯草芽孢杆菌803 产乙偶姻的能力（0.92 mg/mL）远高于王霜等[25]从兼香型白酒酒醅中筛选的地衣芽孢杆菌LS9（0.065 mg/mL）和枯草芽孢杆菌S10（0.041 mg/mL）的产乙偶姻能力，而低于高文睿等[26]从凉州熏醋中筛选的芽孢菌Y4（2.376 mg/mL）。芽孢菌不同，产乙偶姻的能力也不同。目前高产乙偶姻的芽孢菌有分离自土壤中的枯草芽孢杆菌JNA3-10和海洋枯草芽孢杆菌DL01[15]。本文筛选高产乙偶姻的芽孢菌为山西老陈醋土著菌，可应用于陈醋的生产中，从而提高陈醋中川穹嗪的含量。另外，枯草芽孢杆菌803 产酯的能力也较强（9.67 g/100 mL），对于酱香型白酒中的产香芽孢菌已有很多报道，如罗建超等[27]从茅台酒高温大曲中分离筛选出产酱香的枯草芽孢杆菌S1320、解淀粉芽孢杆菌S1011 和地衣芽孢杆菌S1307；吴树坤等[28]从沉香型酒醅中分离筛选出4 株产香较好的芽孢杆菌，它们是阿式芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

由图4 可知，解淀粉芽孢杆菌1539 产多酚的能力（750.96 μg/mL）高于郇阿梅等[12]从四川麸醋醋醅中分离出的芽孢菌YB-32（263.6 μg/mL）的产多酚能力。山西老陈醋是以高梁为主要原料发酵的，高粱中富含多酚类化合物[29]，因此食醋中含有大量的多酚类物质。另外，芽孢菌发酵会促进食醋中多酚含量的提高[30]。山西老陈醋中主要产生的酸为醋酸，不挥发性酸对醋味道和风味的形成非常重要，能够缓解刺激的酸味，使食醋口感相对柔和[31]。除乳酸菌产不挥发性酸外，芽孢菌也是。本文显示，解淀粉芽孢杆菌1539 产不挥发性酸量达2.93 g/L。

图4 山西老陈醋醋醅中分离的芽孢菌产乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸量能力Fig.4 The producing ability of acetoin，polyphenols，total esters and non-volatile acid of bacillus isolated from cupei of Shanxi aged vinegar

2.3 解淀粉芽孢杆菌1539 与枯草芽孢杆菌803的相互作用

2.3.1 纯培养和共培养体系中芽孢菌的生物量变化 根据1.3.4 节方法，将解淀粉芽孢杆菌1539（产多酚、不挥发性酸能力最强）和枯草芽孢杆菌803（产乙偶姻、总酯能力最强）按比例共培养，相互作用。由图5 可知，当解淀粉芽孢杆菌1539∶枯草芽孢杆菌803 为1∶0.1（V/V）和1∶0.5（V/V）共培养时，解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 的生物量与二者1∶1（V/V）时接近；当解淀粉芽孢杆菌1539∶枯草芽孢杆菌803 为1∶10（V/V）共培养时，解淀粉芽孢杆菌1539 生物量略有提高。以上结果说明解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 共培养对其生物量无显著影响。

图5 纯培养和共培养体系中解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 的生长曲线Fig.5 The growth curve of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

2.3.2 纯培养和共培养体系中芽孢菌的乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸含量差异 由图6 可知，以解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 纯培养（1∶0 和0∶1）为对照，研究解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 比例分别为1∶0，0∶1，1∶0.1，1∶0.5，1∶1，1∶5，1∶10（V/V）共培养时对乙偶姻、多酚、总酯、不挥发酸含量的影响。解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 在纯培养（1∶0 和0∶1，V/V）条件下的乙偶姻、总酯含量接近，低于解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 共培养的含量，并且随着枯草芽孢杆菌803 比例的增加，乙偶姻、总酯含量逐渐增大，当解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 按1∶10（V/V）共培养时乙偶姻、总酯含量最高，分别比纯培养提高了96.23%、12.08%。

图6 解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 纯培养和共培养体系中的乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸含量Fig.6 The producing ability of acetoin，polyphenol，total ester，non-volatile acid of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803在纯培养（1∶0 和0∶1，V/V）条件下的多酚含量明显低于解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 共培养的含量，当解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 按体积比为1∶5 和1∶10 共培养时多酚含量较高，分别为179.82 μg/mL 和197.52 μg/mL。解淀粉芽孢杆菌1539、枯草芽孢杆菌803在纯培养（1∶0 和0∶1，V/V）条件下的不挥发酸含量与解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803按1∶0.1，1∶0.5，1∶1（V/V）共培养时的含量接近，当解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 按体积比为1∶5 和1∶10 共培养时不挥发酸的含量较高，分别为6.28 g/L 和8.26 g/L。

微生物的互作是一个精密而复杂的体系，机制复杂，菌体细胞间通过生理接触，产生信号分子及诱导环境变化，从而引起微生物形态和代谢产物的变化。解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 在共培养下，乙偶姻、多酚、总酯、不挥发性酸的含量发生变化，而且均比纯培养时有所提高。孟醒[32]在酱香型白酒酿造来源的酿酒酵母与地衣芽孢杆菌相互作用特征及机制的初步解析中，比较单菌与混菌发酵体系中酿酒酵母的生理代谢特征及其与地衣芽孢杆菌的相互作用，发现酿酒酵母和地衣芽孢杆菌1∶100 混合体系能够产生更多的酯类风味化合物。

2.3.3 纯培养和共培养体系中芽孢菌有机酸含量的差异 有机酸是山西老陈醋总酸中的重要成分，可以缓和陈醋的刺激性，使酸味柔和。以解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 纯培养为对照，研究共培养相互作用对芽孢菌有机酸含量的影响。由图7、图8 可知，解淀粉芽孢杆菌1539和枯草芽孢杆菌803 在纯培养（1∶0 和0∶1，V/V）时，二者的有机酸谱相似，柠檬酸和琥珀酸含量最高；在共培养时，二者比例为1∶0.1，1∶0.5，1∶1（V/V）的有机酸谱相似。解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 为1∶0.5（V/V）共培养时的苹果酸含量最高；二者比例为1∶10（V/V）共培养时，草酸、丙酮酸、酒石酸、乳酸的含量都显著升高，分别比纯培养（1∶0，V/V）时提高89.78%，88.32%，22.92%，32.98%，它们可以缓冲乙酸带来的刺激酸味，使醋的口感变得柔和，其中丙酮酸具有愉快的香味和带有微辣的甜味，可丰富陈醋的口感；乳酸与醇类物质酯化生成脂类物质，如乳酸乙酯，可以很好地改善陈醋的风味。

图7 解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803纯培养和共培养体系中有机酸含量热图Fig.7 Heat map of organic acid content of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

图8 解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 纯培养和共培养体系中有机酸的PCA 分析Fig.8 PCA analysis of organic acid of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

2.3.4 纯培养和共培养体系中芽孢菌挥发性香气成分的差异 风味物质的种类及含量不仅决定山西老陈醋独特的口感及滋味，而且与产品质量密切相关。芽孢菌是多种风味物质的生产菌株，目前已有从酒醅中筛选的地衣芽孢杆菌与拜耳接合酵母菌的相互作用研究，丰富了体系风味研究。由图9 可知，解淀粉芽孢杆菌1539∶枯草芽孢杆菌803共培养1∶10（V/V）时，山西老陈醋挥发性香气成分含量和种类最丰富，其特征风味物质乙酸乙酯、乙酸丁酯、异戊酸乙酯、甲酸异丁酯、异丁酸乙酯等酯类以及异戊醇、正己醇、仲丁醇等醇类和4-壬酮、2-庚酮的含量均显著提高，分别提高85.23%，62.31%，72.16%，46.21%，48.56%，75.56%，32.16%，31.68%，68.49%，51.34%。由图10 可知，在纯培养（1∶0 和0∶1，V/V）时，解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 均位于PC1、PC2 的负方向，挥发性香气种类较少且谱图相似；在共培养时，解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803比例为1∶0.1，1∶0.5，1∶5（V/V）时均位于PC1、PC2的正方向，产挥发性香气成分的种类及含量相近；解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803比例为1∶10（V/V）时，位于PC1 的正方向，PC2的负方向，而风味物质多集中于PC1 的正方向，说明二者共培养1∶10 时，风味物质种类最丰富。

图9 解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 纯培养和共培养体系中各风味物质含量Fig.9 Heat map of volatile aroma components of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

图10 解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 纯培养和共培养体系中风味的PCA 分析Fig.10 PCA analysis of the volatile aroma components of Bacillus amyloliquefaciens 1539 and Bacillus subtilis 803 in pure and co-culture

具有果香味的乙酸乙酯、乙酸丁酯，具有香蕉香气和酸甜气味的异戊酸乙酯，具有朗姆酒甜香味的异丁酸乙酯，具有苹果白兰地香气和辛辣味的异戊醇，具有淡青嫩枝叶气息的正己醇等风味共同协调，构成山西老陈醋的独特风味，使其不刺激，香不掩体夺主，酸香，醇厚，略带甜味的风格更加生动。另外，在解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 共培养1∶10（V/V）时，椰子醛、苯乙醛、癸醛、糠醛、壬醛等醛类物质含量显著降低，微量的醛类所形成的辣味，对陈醋的五味调和起到一定的作用，而醛类含量过多，会有较重的辛辣味，刺激性较大[31]。综上可知，与纯培养时相比，解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 的混合培养体系中部分挥发性香气成分的含量及种类增多，这些香气成分是山西老陈醋中的主要特征风味物质，其含量变化对山西老陈醋品质有重要影响。

2.4 醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌的相互作用

2.4.1 纯培养和共培养体系中醋酸菌、乳酸菌和芽孢菌的生物量变化 醋酸菌、乳酸菌是山西老陈醋醋酸发酵过程的主要菌种。在此过程中，芽孢菌作为协调菌，在山西老陈醋中产生丰富的香味物质。高通量测序结果表明：巴氏醋杆菌和植物乳杆菌是山西老陈醋醋酸发酵阶段的优势菌株。根据1.3.5 节方法对巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19以及分离自醋醅的解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 进行互作研究。由图11 可知，当巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19 以及解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 共培养时，它们的生物量均低于纯培养的生物量。从山西老陈醋醋醅中分离筛选到的2 株优势芽孢菌解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803，对巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19 的生长均无抑制作用。刘敏[33]筛选产酸芽孢菌，将其与乳酸菌混合发酵，结果表明枯草芽孢杆菌23-1 对保加利亚乳杆菌L1 的生长影响虽不显著，但可以刺激保加利亚乳杆菌的产酸能力，其互作机理还有待研究。

图11 纯培养和共培养体系中醋酸菌、乳酸菌与芽孢菌的生长曲线Fig.11 The growth curve of acetic acid bacteria，lactic acid bacteria and bacillus in pure and co-culture

2.4.2 纯培养和共培养体系中挥发性香气成分的差异 含有醇类、醛类、酸类、酯类、酮类、杂环类等各种物质，对山西老陈醋香味物质的呈现有重要影响，这些物质的种类、含量及比例变化与食醋香气类型的构成有着非常密切的关系。以香味物质为主要参考指标进行陈醋发酵菌种的选择具有重要的作用，因此，研究芽孢菌、醋酸菌和乳酸菌纯培养与共培养的挥发性香气成分具有重要意义。由图12 可知，从风味物质的组成和含量变化来看，巴氏醋杆菌33 和植物乳杆菌19 共培养有利于山西老陈醋中贡献风味物质的形成，其中具有花香、甜香的苯甲醇，水果香的乙酸乙酯，甜蜜香味的乙酸苯乙酯，巧克力和奶油风味的2，5-二甲基吡嗪等对山西老陈醋风味有贡献，分别提高了42.16%，64.23%，56.89%，31.26%。当巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19 以及解淀粉芽孢杆菌1539和枯草芽孢杆菌803 培养时，挥发性香气成分含量和种类最丰富，其中，乙酸乙酯、异戊酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸异丁酯、壬酸乙酯、乙酸、2-甲基己酸、3-氨基丁酸、1-壬醇、1-辛烯-3-醇、2-甲基丁醇、3-壬醇、苯乙醇、庚醇、椰子醛、癸醛、2-庚酮的含量均显著提高。

图12 醋酸菌、乳酸菌与芽孢菌纯培养和共培养体系中各风味物质含量Fig.12 Heat map of volatile aroma components of acetic acid bacteria，lactic acid bacteria and bacillus in pure and co-culture

由图13 可知，当巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19 以及解淀粉芽孢杆菌1539 和枯草芽孢杆菌803 共培养时位于PC1 的负方向，PC2 的正方向，而风味物质多集中于PC1 的负方向，说明共培养时风味物质丰度最高。而具有水果香味的乙酸乙酯，香蕉香气和酸甜气味的异戊酸乙酯，蘑菇香、水果香的1-辛烯-3-醇，甜橙油和柠檬油香气的癸醛是山西老陈醋的特征香气物质，可以丰富山西老陈醋的口感，分别比纯培养时提高了78.65%，49.26%，42.17%，52.69%。上述结果说明醋酸菌、乳酸菌、芽孢菌协同发酵有利于山西老陈醋风味的形成，应进一步研究混合菌相互机理。

图13 醋酸菌、乳酸菌与芽孢菌纯培养和共培养体系中风味的PCA 分析Fig.13 PCA analysis of the volatile aroma components of acetic acid bacteria，lactic acid bacteria and bacillus in in pure and co-culture

3 结论

从山西老陈醋酿造过程中分离出的54 株芽孢菌中，筛选1 株产多酚和产不挥发性酸能力强的解淀粉芽孢杆菌1539 以及1 株产乙偶姻和产酯能力强的枯草芽孢杆菌803，通过组合发酵研究二者共培养时的代谢变化，结果表明：以1∶10（V/V）的比例共培养时，发酵液中乙偶姻、多酚、总酯及不挥发性酸含量均显著提高，典型挥发性香气物质的种类和含量也显著提高。将其芽孢菌和巴氏醋杆菌33、植物乳杆菌19 共培养发酵研究其代谢变化，结果三者等比例共培养时丰富了挥发性香气谱图，并且山西老陈醋的特征风味物质含量也显著提高，证明了芽孢菌具有作为山西老陈醋强化直投式发酵剂的巨大潜力。