卵白蛋白体外模拟胃肠道消化产物的抗氧化活性及其结构表征

姜 丰，刘静波，马思彤，杨 萌，陈 艳，刘博群，张 婷*

（1 吉林省营养与功能食品重点实验室 长春130062 2 吉林大学食品科学与工程学院 长春130062）

鸡蛋富含多种优质蛋白质，是人们餐桌上常见的蛋白质来源[1]。蛋白质主要分布在蛋清和蛋黄中，蛋清中蛋白以卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵黏蛋白以及伴白蛋白等形式存在；蛋黄中蛋白以高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和肝素等形式存在[2-3]。研究表明，鸡蛋中多种蛋白具有抗氧化活性，其中，卵白蛋白作为蛋清蛋白的主要成分，约占54%，是一种由385 个氨基酸组成的糖蛋白，含有6 个具有二硫键的半胱氨酸残基，是唯一含有游离硫醇基团（SH）的蛋清蛋白[2，4]，因而卵白蛋白能与自由基直接反应，从而具有较强的抗氧化活性[5-6]。Liu等[7]为改善姜黄素的功能特性，利用卵白蛋白制成卵白蛋白-姜黄素复合物，与纯姜黄素相比，复合物的抗氧化活性提高。

目前对卵白蛋白抗氧化性的研究主要集中在酶解或改性前、后体外活性评价。卵白蛋白最终对人体的健康益处与其在体内的生物利用度密切相关。评价生物利用度有体内和体外两类模型，体内主要是动物模型。动物模型虽然能够真实地还原生理条件下的消化过程，但是存在以下问题：实验周期长，成本高，并且由于个体差异问题，容易造成结果的重复性差。评价卵白蛋白生物利用度的体外模型主要是体外模拟胃肠道消化模型，体外模拟消化能够在一定程度上模拟生理状况，并且试验易操作，成本低、周期短[8-9]。

本试验以卵白蛋白及其体外模拟胃肠道消化产物为研究对象，探究卵白蛋白经体外模拟胃肠道消化后的抗氧化活性变化。测定其ABTS+·清除活性和ORAC，评价体外抗氧化活性。利用H2O2诱导Caco-2 细胞氧化损伤，构建细胞氧化损伤模型，探究其体内抗氧化活性。以期阐明卵白蛋白经体外模拟胃肠道消化后抗氧化活性变化规律，为后续研究蛋白及其产物在体内消化、吸收提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵白蛋白、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）、2，2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（2，2’-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH）、荧光素钠、细胞内ROS 检测试剂盒等，美国Sigma 公司；合成肽CFDV、CVSP、MPFR（纯度＞95%），生工生物工程（上海）股份有限公司；人结肠癌细胞（Caco-2），中国科学院上海细胞库；DMEM 培养基，美国Gibco 公司；H2O2（分析纯），北京化工厂；细胞增殖检测试剂盒（MTS），美国Promega 公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；黑色孔板（透明平底），德国Greiner Bio-One 公司；移液器，德国Eppendorf 公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；EASY-nLC 1000 液相色谱仪，美国Thermo Scientific 公司；Orbitrap EliteTM组合型离子阱Orbitrap 质谱仪，美国Thermo Scientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 体外模拟胃肠道消化 参照Alting 等[33]报道的方法并稍作修改。称取10 g 卵白蛋白，加入1 L 蒸馏水配制成质量分数1%的蛋白溶液。加质量分数2%的胃蛋白酶（EC 3.4.23.1，来源于猪胃黏膜，酶活力为3 000 units/mg），用1 mol/L 的HCl将pH 值调至2，保持体系温度在37 ℃，持续酶解90 min。用1 mol/L 的NaOH 调pH 值至7，加入质量分数4%的胰液（EC 3.4.21.4，来源于猪胰腺，酶活力为250 units/mg），保持温度37 ℃和pH 7，持续酶解4 h。将体系沸水浴10 min 灭活蛋白酶，冷却至室温。将酶解液离心，在4 ℃下10 000 r/min离心10 min，收集上清液，-20 ℃贮存备用。

1.3.2 卵白蛋白及其消化产物体外抗氧化活性测定

1.3.2.1 卵白蛋白及其消化产物ABTS+·清除能力测定 配制7 mmol/L ABTS 溶液和4.9 mmol/L 的K2S2O8溶液，将二者等体积混合配置得到ABTS 储备液。将储备液于室温避光条件下静置12～16 h后，用PBS 将储备液稀释20～30 倍，使其在734 nm 下的吸光度为0.7±0.02，形成ABTS 工作液。96孔板按如下设置加入溶液：空白组：200 μL PBS、对照组180 μL ABTS 工作液和20 μL PBS 以及试验组：180 μL ABTS 工作液和20 μL 样品溶液（0.5，1，5 和10 μg/mL），每组3 个复孔。将96 孔板放入酶标仪中，振荡10 s 后，室温静置5 min 后，测定反应体系在734 nm 下的吸光度值。计算ABTS 自由基清除能力（%）的公式为：

式中：A0——空白组的吸光度；A1——对照组的吸光度；A2——试验组的吸光度。

样品的ABTS 自由基清除能力用Trolox 抗氧化当量（TEAC，μmol/L TE/g 样品）表示，即一定浓度的样品溶液相当于多少浓度的Trolox 溶液。

从式中可以得出，当旋流器直径增加时，其处理量成Q∝D2增加，矿浆向心流速减小，而由于分级粒度d∝D，则旋流器直径越大分级粒度越大，所以大直径旋流器可以提高分级下限，提高底流中粗粒级的含量。基于此，决定将3338号旋流器组更换为大直径水力旋流器。

1.3.2.2 卵白蛋白及其消化产物ORAC 测定 配制116 nmol/L 的荧光素钠溶液和40 mmol/L 的AAPH 溶液。在黑色96 孔板中首先按如下设置加入溶液，空白组：120 μL 荧光素钠溶液和20 μL PBS；样品组：120 μL 荧光素钠溶液和20 μL 样品溶液（10 μg/mL）；Trolox 组（标准品组）：120 μL 荧光素钠溶液和20 μL Trolox 溶液（1 μg/mL），混合上述体系，在37 ℃下预热2 min 后，快速加入60 μL AAPH 溶液启动反应。将黑色96 孔板立即放入酶标仪中，设置温度37 ℃，激发波长485 nm，发射波长520 nm，每隔2 min 振板10 s 并检测1 次，连续测定600 min。将每次测定值连成曲线，按下述公式计算荧光曲线下的面积：

式中：f0——0 min 时的测定值；fi——imin 时的测定值。Net AUC 按下述公式计算：

1.3.3 卵白蛋白及其消化产物的细胞抗氧化活性

1.3.3.1 卵白蛋白及其消化产物的毒性作用Caco-2 细胞按照参考文献[10]的方法进行培养。将处于对数生长期的Caco-2 细胞以2×104cells/孔的密度接种于96 孔板中，分别设置空白组、对照组和试验组，每个浓度6 个复孔。空白组加入80 μL 的培养基，试验组和对照组加入80 μL 细胞悬液，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育12 h 后，空白组和对照组加入10 μL DMEM 无血清高糖培养基，试验组分别加入10 μL 终质量浓度为0.01，0.1，1 mg/mL 的样品溶液，继续孵育12 h 后，各组均加入10 μL DMEM 无血清高糖培养基，孵育6 h 后，利用MTS 法[11]测定细胞存活率。

1.3.3.2 H2O2诱导Caco-2 细胞氧化损伤模型的建立 Caco-2 细胞按照参考文献[10]的方法进行培养。将处于对数生长期的Caco-2 细胞以2×104细胞/孔的密度接种于96 孔板中，分别设置空白组、对照组和试验组，每个浓度6 个复孔。空白组加入80 μL 的培养基，试验组和对照组加入80 μL 细胞悬液，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育12 h 后，各组均加入10 μL DMEM 无血清高糖培养基，继续孵育12 h 后，空白组和对照组加入10 μL DMEM 无血清高糖培养基，试验组分别加入10 μL 终浓度为 400，500，600，700，800，900 μmol/L 的H2O2溶液，孵育6 h 后，利用MTS 法[11]测定细胞存活率。选取细胞存活率50%所对应的H2O2浓度为构建Caco-2 细胞氧化损伤模型的最佳浓度。

1.3.3.3 卵白蛋白及其消化产物对Caco-2 细胞氧化损伤的保护作用 Caco-2 细胞按照参考文献[10]的方法进行培养。将处于对数生长期的Caco-2 细胞以2×104细胞/孔的密度接种于96 孔板中，分别设置空白组、对照组和试验组，每个浓度6 个复孔。空白组加入80 μL 的培养基，试验组和对照组加入80 μL 细胞悬液，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育12 h 后，空白组和对照组加入10 μL DMEM 无血清高糖培养基，试验组分别加入10 μL 终质量浓度为0.01，0.1，1 mg/mL 的样品溶液，继续孵育12 h 后，空白组和对照组加入10 μL DMEM 无血清高糖培养基，试验组加入10 μL 终浓度为700 μmol/L 的H2O2溶液，孵育6 h后，利用MTS 法[11]测定细胞存活率。

1.3.4 卵白蛋白消化产物对H2O2诱导的Caco-2细胞内ROS 的清除作用 细胞内ROS 含量的测定采用文献中报道的DCFH-DA 荧光探针法[12]，并稍作修改。细胞孵育以及试验设置同1.3.3.3 节，经过最后一步H2O2孵育6 h 后，将96 孔板中上清液吸弃，用PBS 清洗细胞后，每孔加入20 μL DCFH-DA 溶液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育20 min 后，用PBS 清洗细胞3 次后加入DMEM，用酶标仪测定其在激发波长485 nm、发射波长525 nm 下的荧光强度。

1.3.5 体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）肽序列鉴定

1.3.5.2 肽的合成 通过高效液相色谱-串联质谱鉴定的肽，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，纯度达到98%以上。

1.3.6 合成肽的体外抗氧化活性

1.3.6.1 合成肽的ABTS+·清除能力测定 方法同1.3.2.1 节。

1.3.6.2 合成肽的ORAC 测定 方法同1.3.2.2节。

1.4 数据统计分析

试验结果用平均值±标准差表示，重复3 次。用SPSS 18.0 软件对数据进行显著性分析，P<0.05为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 卵白蛋白及其消化产物的体外抗氧化活性

2.1.1 ABTS+·清除能力测定 蛋白以及蛋白产物的ABTS 自由基清除活性结果如图1所示。可以看出，卵白蛋白及其消化产物对ABTS 自由基的清除能力均具有浓度依赖性，大小顺序依次为：体外模拟胃肠道消化产物<1 ku、体外模拟胃肠道消化产物1～3 ku、体外模拟胃肠道消化产物3～10 ku、卵白蛋白，说明卵白蛋白经过体外模拟胃肠道消化后，其消化产物的ABTS 自由基清除活性均有不同程度的增强，这一结论与文献中已有的报道相符[10-13]，说明蛋白经过体外模拟胃肠道消化后，产生了新的具有抗氧化活性的肽段或氨基酸[14-15]。可以发现，分子质量越小的组分表现出越强的ABTS 自由基清除活性，其中，分子质量<1 ku的组分ABTS 自由基清除能力最强，与其它组分存在显著性差异（P<0.05），最高浓度清除率达49.48%，Foh 等[16]以罗非鱼为原料，得到蛋白水解物，同样发现了分子质量<1 ku 的组分清除ABTS自由基的能力最强，高于分子质量<3 ku 的组分和分子质量<5 ku 的组分。

图1 卵白蛋白及其消化产物的ABTS+·清除能力Fig.1 ABTS+·scavenging ability of ovalbumin and its digested products

2.1.2 ORAC 测定 蛋白以及蛋白产物的氧自由基吸收能力结果如图2所示。ORAC 值最大的组分仍然为体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku），依次为体外模拟胃肠道消化产物（1～3 ku）、体外模拟胃肠道消化产物（5～10 ku）、卵白蛋白。其中体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）和体外模拟胃肠道消化产物（1～3 ku）的ORAC 值分别为1.21 μg/mL TE/μg/mL 和2.07 μg/mL TE/μg/mL，高于Trolox的ORAC 值（1 μg/mL TE/μg/mL）。这一结果与上述结果一致，说明经过体外模拟胃肠道消化，卵白蛋白被酶解，释放出新的抗氧化肽段，抗氧化肽段表现出更强的氧自由基吸收能力，并且分子质量越小的肽段，ORAC 值越大。这一结果与文献中已有的报道相符：Vilcacundo 等[13]以藜麦蛋白为原料，经过体外模拟胃肠道消化后，分子质量<5 ku的组分ORAC 值高于分子质量>5 ku 的组分。

图2 卵白蛋白及其消化产物的氧自由基吸收能力Fig.2 Oxygen free radical absorption capacity of ovalbumin and its digested products

2.2 卵白蛋白及其消化产物的细胞抗氧化活性

2.2.1 H2O2诱导的Caco-2 细胞氧化损伤模型的建立 不同浓度的H2O2对Caco-2 细胞存活率的影响如图3所示。H2O2容易通过细胞膜，在细胞内产生高活性自由基，从而引发机体氧化应激，最终导致细胞损伤或凋亡[18]。当H2O2浓度由400 μmol/L 增加到900 μmol/L 时，细胞存活率逐渐降低，与未经H2O2处理组（对照组）存在显著性差异，当H2O2浓度在700 μmol/L 时，细胞存活率为48%，约为对照组细胞存活率的50%，当H2O2浓度在900 μmol/L 时，细胞存活率为13%，细胞氧化损伤过于严重，此时蛋白及其产物难以表现出对细胞的保护作用，综合以上因素，选用700 μmol/L 的H2O2构建细胞氧化损伤模型，探究体外模拟胃肠道消化的卵白蛋白产物的细胞抗氧化活性。

图3 H2O2 对Caco-2 细胞的损伤作用Fig.3 Damage effect of H2O2 on Caco-2 cells

2.2.2 卵白蛋白消化产物对Caco-2 细胞氧化损伤的保护作用 卵白蛋白体外模拟胃肠道消化产物对H2O2诱导的细胞氧化应激损伤的保护作用结果如图4所示。按照2.2.1 节构建得到的细胞氧化损伤模型，H2O2处理组（损伤组）细胞存活率约为对照组的50%，与对照组存在显著性差异（P<0.05）。在H2O2处理细胞之前，用不同质量浓度的肽（0.01，0.1，1 mg/mL）处理细胞，体外模拟胃肠道消化产物（3～10 ku）和体外模拟胃肠道消化产物（1～3 ku）细胞存活率与损伤组细胞没有显著性差异（P>0.05），对细胞没有氧化损伤的预先保护作用。当体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）质量浓度为0.01 mg/mL 时，细胞存活率与损伤组细胞没有显著性差异（P>0.05），随着产物浓度的升高，细胞存活率逐渐提高，与损伤组存在显著性差异（P<0.05），表明体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）对H2O2诱导的细胞氧化应激损伤具有保护作用。值得注意的是：由于模型中所采用的细胞为人结肠癌细胞系（Caco-2 细胞），Caco-2 细胞经分化后类似小肠细胞并可表达成熟的小肠细胞的特征，进而该细胞被广泛用于吸收模型研究。推测卵白蛋白经过体外模拟胃肠道消化后，被Caco-2 细胞吸收，在细胞内发挥保护作用，从而提高细胞存活率。并且，在未经H2O2处理、消化质量浓度为1 mg/mL 时，细胞存活率与对照组相比表现为既不升高也不降低，与对照组无显著性差异（P>0.05），表明消化产物对Caco-2 细胞既没有毒性作用，也不促进细胞增殖。

图4 卵白蛋白消化产物对Caco-2 细胞氧化损伤的保护作用Fig.4 Protective effect of ovalbumin digestion products on oxidative damage of Caco-2 cells

2.2.3 卵白蛋白消化产物对Caco-2 细胞内ROS的清除作用 DCF 的荧光强度反映了细胞内ROS的含量。如图5所示，对照组荧光强度最低，即细胞内ROS 含量最低，而损伤组细胞荧光强度与对照组相比显著增加，表明由于H2O2对细胞的损伤作用，细胞发生氧化应激，细胞内ROS 显著增加。而经过消化产物预先处理的试验组，除低质量浓度（0.01 mg/mL）的体外模拟胃肠道消化产物（3～10 ku）外，均与损伤组存在显著性差异（P<0.05），表明消化产物能够减少细胞氧化损伤产生的过量ROS。值得注意的是，ROS 含量在低质量浓度（0.01 mg/mL）和中质量浓度（0.1 mg/mL）组表现出浓度依赖性，而在中质量浓度（0.1 mg/mL）和高质量浓度（1 mg/mL）组没有表现出由于浓度产生的差异。研究表明，蛋白或肽段可能是由于刺激了细胞内与抗氧化相关的信号通路，从而发挥抗氧化作用[19-22]。那么，消化产物对细胞内ROS 的清除在中、高浓度组无差异的原因可能是：一方面，由于肽被细胞吸收的量达到饱和；另一方面，由于通路蛋白受体饱和。如图5所示，0.1 mg/mL 的体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）的荧光强度与对照组无显著性差异，说明其已经能将氧化损伤的Caco-2 细胞内的ROS 清除到接近正常水平，具有较强的细胞抗氧化活性。

图5 卵白蛋白消化产物对Caco-2 细胞内ROS 的清除作用Fig.5 Scavenging effects of ovalbumin digestion products on ROS in Caco-2 cells

2.3 体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）肽序列鉴定

从消化产物中抗氧化活性最强的组分中鉴定出3 条肽序列，二级质谱图如图6所示。利用电喷雾轨道阱对扫描离子进行碰撞诱导解离（Collision-Induced Dissociation，CID），在低能CID 下（10～200 eV），多肽链只在酰胺键处发生断裂，因此主要产生b 离子和y 离子碎片[23]。采用文献中报道的从头测序的方法[24-27]，对多肽序列进行鉴定，得到3 条四肽，分别为CFDV、CVSP 和MPFR，通过与已知卵白蛋白氨基酸序列对比，这3 条肽分别位于卵白蛋白12～15、383～386 和197～200 氨基酸残基[28]。

图6 CFDV、CVSP 和MPFR 的质谱图Fig.6 Mass spectrum of CFDV，CVSP and MPFR

2.4 合成肽的体外抗氧化活性

2.4.1 ABTS+·清除能力测定 3 种合成肽的ABTS 自由基清除活性如图7所示。CFDV 和CVSP 表现出明显的ABTS 自由基清除能力，并且具有浓度依赖性。与之相比，MPFR 则没有明显的ABTS 自由基清除能力，自由基清除率不足5%。与混合组分体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）相比，CFDV 和CVSP 在较低质量浓度范围（0.5，1，5 和10 μg/mL）就能表现混合组分相当的ABTS 自由基清除能力，在质量浓度为10 μg/mL 时，这两种肽的ABTS 自由基清除活性已经接近100%，说明这两种合成肽的ABTS 自由基清除能力高于混合组分体外模拟胃肠道消化产物（<1 ku）。研究表明，多肽的抗氧化活性与氨基酸组成有关，CFDV 和CVSP 的强ABTS+·清除能力可能与肽链N 端的半胱氨酸（C）有关[29]，半胱氨酸含有的硫醇基能直接与自由基反应，从而增强了其清除自由基的能力[30]。

图7 合成肽的ABTS+·清除能力Fig.7 ABTS+·scavenging ability of synthetic peptides

2.4.2 ORAC 测定 合成的3 种纯肽的氧自由基吸收能力结果如图8所示。不同于ABTS 自由基清除活性，3 种合成肽均表现出较强的氧自由基吸收能力，10 μg/mL 的CFDV、CVSP 和MPFR 的ORAC 值分别为1.87，1.28 和1.57 μg/mL TE/μg/mL，均高于同浓度的Trolox（1 μg/mL TE/μg/mL），说明，3 个多肽的体外抗氧化能力较强，这与多肽中含有Phe（F）、Val（V）以及Met（M）等疏水性氨基酸有关[32-33]。其中，MPFR 无明显的ABTS 自由基清除能力，但是具有较强的ORAC 活性，这是由于这两种测定体外抗氧化活性的方法原理的差异导致[34]。

图8 合成肽的氧自由基吸收能力（ORAC）Fig.8 Oxygen free radical absorption capacity of synthetic peptides

3 结论

本文研究了经体外模拟胃肠道消化的卵白蛋白产物的抗氧化性。发现体外模拟胃肠道消化能够提高卵白蛋白ABTS+·清除活性和ORAC 值，并且组分分子质量越小，其抗氧化性越强；分子质量<1 ku 的产物对H2O2诱导的Caco-2 细胞氧化损伤具有保护作用；3 种组分均对细胞内氧化应激产生的ROS 具有清除作用，并且具有浓度依赖性。从抗氧化活性最强的组分（分子质量<1 ku 的产物）鉴定出3 条四肽序列，结果显示CFDV 和CVSP 表现出明显的ABTS+·清除能力，并且具有浓度依赖性；CFDV、CVSP 和MPFR 均表现出较强的氧自由基吸收能力。以上结果显示，体外模拟胃肠道消化对卵白蛋白抗氧化活性的提高以及抗氧化活性肽段的释放具有积极作用，卵白蛋白经体内消化后抗氧化活性变化规律及机制有待进一步研究。