末水紫菜发酵液抗氧化活性与植物生长调节剂研究

杨 帆，杨 敏，徐春羽，庞思思，王晓梅，胡祖广，张忠山

(1.湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州 313000;2.宁波莫宁森家庭农场有限公司，浙江 宁波 315734)

0 引 言

坛紫菜(Porphyrahaitanensis)隶属红藻门(Rhodophyta)红毛菜科(Bangiacea)紫菜属(Porphyra)，占我国紫菜总产量的50%以上[1].紫菜主要分5次采收，即头水、二水、三水、四水和末水紫菜，其营养价值逐渐降低，粗纤维含量不断上升[2].末水紫菜价格低，多数养殖户都不予采收.但末水紫菜作为一种丰富的海洋资源，其生产效益有待进一步开发.

坛紫菜含有大量的微量元素和无机盐类，且鲜美可口，除食用外还可有效治疗甲状腺水肿和减少体内胆甾醇，同时具有降血脂、抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗辐射和抗癌的作用[3-8]，是一种重要的经济海藻.目前将紫菜发酵液作为类似植物生长激素方面的报道还不多见.本文以末水紫菜微生物发酵提取液为研究对象，探究不同样品的抗氧化自由基活性，并通过种子发芽试验来确定末水紫菜发酵液的生物调节作用，全面测定末水紫菜发酵液的各组成含量，进一步证明末水紫菜发酵液在抗氧化、植物生长调节[9]等方面的潜力，实现末水紫菜的高值化利用.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

末水紫菜(2019年10月采摘自温州洞头)、硝基四氮唑蓝(NBT)(国药集团生产)、吩嗪硫酸钾酯(PMS)(上海源叶生物科技有限公司生产).其他试剂均为国产分析纯.

RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、UV-1100D，UV-1200型紫外/可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器公司)、全温振荡器(常州亿通分析仪器制造有限公司)等.

1.2 方 法

1.2.1 酵母菌活化

称取安琪干酵母4.0 g，加入60 mL无菌水，置于37 ℃恒温箱内活化30 min，至表面出现大量气泡即可使用.

1.2.2 末水紫菜发酵液的制备

末水紫菜发酵液生产流程见图1.

图1 末水紫菜发酵液生产流程Fig.1 Production process of dried laver fermentation broth

前处理：将末水紫菜置于恒温箱中干燥，粉碎过筛制成干品.

浸泡：称取干品1、干品2、干品3三份原料，分别按照料液比1∶10、1∶15、1∶20加入100 mL无菌水，机械混合均匀制成末水紫菜原液.

高温灭菌：将上述末水紫菜原液置于121 ℃高温中灭菌30 min.

接种：待处理好的末水紫菜源液冷却至常温后，在无菌操作台上将活化的酵母菌接种至灭菌后的末水紫菜原液中，接种量为4%.

发酵：接种完成后置于30 ℃的全温振荡器中培养48 h.

离心：将发酵液离心并过滤得到上清液，即为末水紫菜发酵液，并分别标号为样品1、样品2、样品3，冷藏，备用于各项指标的检测.

1.2.3 末水紫菜发酵液抗氧化活性的测定

末水紫菜发酵液总抗氧化能力按照钼酸铵体系方法检测[10]，DPPH自由基清除能力按照文献修改检测[11]，超氧阴离子清除活性按照NADH-NBT方法检测并稍作修改[12]，还原活性按照铁氰化钾-三氯化铁方法测定并稍作修改[13].

1.2.4 末水紫菜发酵液的组成分析

总糖含量的测定采用苯酚硫酸法[14]；蛋白质含量的测定采用Bradford法[15]；有机质、总氮磷钾、重金属含量的测定分别参照标准NYT1976-2010《水溶肥料 有机质含量的测定》、NYT1977-2010《水溶肥料 总氮磷钾含量的测定》、NY 1110-2010《水溶肥料 汞、砷、镉、铅、铬的限量要求》[16-18].

1.2.5 种子发芽实验

筛选颗粒均匀、大小一致的黄瓜、小麦种子进行试验.根据预试验结果，种子灭菌后置于保温箱内用抗氧化活性与组成成分较优的末水紫菜发酵液浸泡12 h；以培养皿为容器，在培养皿底部放无菌滤纸制成发芽床；取3个浓度的末水紫菜发酵液浇灌发芽床，以无菌蒸馏水浇灌作为对照，将种子均匀地排列在发芽床上[19]，每处理3次重复.

种子发芽率与自毒效应指数按如下公式计算：

发芽率(%)=(发芽终期正常发芽种子数/全部种子数)×100%.

根据各处理发芽率(T)和对照发芽率(C)计算自毒作用指数(RI)：

RI=(T-C)/C.

当RI>0时，表示末水紫菜发酵液对种子发芽具有促进作用；当RI<0时，表示末水紫菜发酵液对种子发芽具有抑制作用.

2 结果与讨论

2.1 末水紫菜发酵液的组成成分

3种料液比样品均为液体，颜色呈棕色，样品2的颜色较深且呈红棕色.各样品溶液都有一定的粘度.

半乳糖标准曲线的相关系数：R2=0.980 3，Y=6.735 7X-0.054 6.

蛋白质标准曲线的相关系数：R2=0.998 8，Y=6.644 8X+0.001 6.

由表1可见：3种样品的总糖含量较高，随着料液比的不断下降，总糖含量也不断降低，样品1的总糖量为1.5 g/L(最高值)，样品3的总糖量为0.5 g/L(最低值)；3种样品的蛋白质含量差异较大，且总蛋白含量随着料液比的下降不断减少，样品1的最大蛋白质含量为1.2 g/L，是样品3的11倍；3种样品的有机质含量差异较小，其含量随着料液比的不断下降而降低，样品1的有机质含量最大值为24.3 g/L，样品3的有机质含量最低，仅为15.5 g/L；3种样品的磷(以P2O5计)含量较低，均低于0.3 g/L，钾元素含量较高，这与末水紫菜内含有大量的钾元素相关，料液比对氮元素含量影响较低，基本可以忽略.

表1 不同样品组成含量分析

2.2 重金属元素含量

由表2可见，3种样品的重金属含量均处于标准值内，汞、镉含量与料液比成正比，且各重金属含量均低于限量值，完全符合水溶肥料汞、砷、镉、铅、铬的限量要求.

表2 不同样品重金属含量

从总体看，在末水紫菜发酵液的化学组成方面，其内部组成与料液比存在线性关系，且料液比主要影响蛋白质、总糖、有机质和钾元素的含量.样品1的总糖含量高达1.5 g/L，是样品2的1.3倍，是样品3的2.7倍.样品1在蛋白质、有机质和钾含量上存在较大优势，尤其在钾元素方面，样品1的钾含量远高于其他两种样品.3种样品的重金属含量没有较大差别.

2.3 末水紫菜发酵液的抗氧化活性

2.3.1 总抗氧化活性

各样品的总抗氧化活性见图2.由图2可见：3种样品的总抗氧化活性良好，且随着浓度的增加而增大；样品1和样品2的抗氧化活性优于样品3；3种样品的总抗氧化活性均在原液浓度为0.2 mg/mL时达到最高值.由此可知，末水紫菜发酵液的总抗氧化活性与浓度成正比.

图2 末水紫菜发酵液的总抗氧化活性Fig.2 Total antioxidant activity of the fermented broth of dried laver

2.3.2 DPPH自由基清除活性

各样品对DPPH自由基的清除活性见图3.实验结果显示：3种样品对DPPH自由基均有不同程度的清除作用，其清除能力与浓度成正比;在浓度为0～0.037 5 mg/mL时，样品3对DPPH自由基的清除率呈现明显的上升趋势;在0.037 5～0.075 mg/mL时，样品3对DPPH自由基的清除效果趋于平缓;在最大浓度为0.075mg/mL时，3种样品对DPPH自由基的清除率分别为19.67%、81.38%和77.47%.

图3 末水紫菜发酵液的DPPH自由基清除活性Fig.3 DPPH free radical scavenging activity of the fermented broth of dried laver

2.3.3 超氧阴离子清除活性

图4 末水紫菜发酵液的超氧阴离子清除活性Fig.4 Superoxide anion scavenging activity of the fermented broth of dried laver

2.3.4 铁离子还原活性

各样品对铁离子的还原活性见图5.由图5可见：3种样品的末水紫菜发酵液对铁离子均有不同程度的还原活性，其还原活性随原液浓度的增大而增强，且样品1的还原活性显著高于其他两种样品；在最大浓度时，3种样品达到的最大吸光度为1.285、0.717和0.684.

图5 末水紫菜发酵液的铁离子还原活性Fig.5 Iron ion reduction activity of the fermented broth of dried laver

从整体看，不同料液比的末水紫菜发酵液的抗氧化活性差异较大.样品1的总抗氧化活性达2.4，是样品2的1.2倍和样品3的1.9倍.尽管样品1的DPPH清除活性不太理想，但在超氧阴离子清除活性和铁离子还原活性方面具有良好的抗氧化作用.

2.4 种子发芽实验

2.4.1 末水紫菜发酵液对小麦种子发芽率的影响

根据上述实验结果，本文选取样品1进行小麦种子萌发实验.如表3所示，样品1加水稀释200倍处理后的小麦种子发芽率最高，稀释100倍、400倍处理后的小麦种子发芽率依次为97.14%、98.57%，其中稀释200倍处理后的小麦种子自毒效应指数(RI)高于其它两个稀释液.

表3 末水紫菜发酵液不同稀释倍数处理对小麦种子发芽率和RI的影响

2.4.2 末水紫菜发酵液对黄瓜种子发芽率的影响

如表4所示，样品1稀释200倍处理后的黄瓜种子发芽率最高，稀释100倍、400倍处理的黄瓜种子发芽率依次为72%、80%，其中稀释200倍处理后的黄瓜种子自毒效应指数(RI)高于其他两个稀释液.由此表明，末水紫菜发酵液对黄瓜种子发芽具有极大的促进作用.

表4 末水紫菜发酵液不同稀释倍数处理对黄瓜种子发芽率和RI的影响

3 讨 论

通过3个不同体系的实验，测定3种末水紫菜发酵液的抗氧化活性，并对其组成成分及其对种子萌发的影响进行分析.结果显示：在抗氧化能力方面，3种末水紫菜发酵液均具有抗氧化活性，最强抗氧化样品1的液料比为1∶10，尽管其对DPPH清除活性不太理想，但在超氧阴离子清除活性和铁离子还原活性方面具有良好的抗氧化作用；在组成含量分析方面，总糖、蛋白质、有机质含量均与料液比呈线性关系，特别在蛋白质方面，样品1的蛋白质含量最大值为1.2 mg/mL，是样品3的11倍，且在钾含量方面，样品1占有绝对优势；选取较优的抗氧化组分和组分含量较高的样品1进行种子萌发实验的结果表明，加入发酵液处理的种子发芽率均比空白对照组高，且原液稀释200倍处理的小麦种子发芽率达100%，较空白对照组增长4.3%，黄瓜种子发芽率达84%，较空白对照组增长14%.由此可见，末水紫菜发酵液较优的发酵工艺可以解决因其利用率不高而随意丢弃导致的生态污染问题.对紫菜发酵液的深度研究能更好地促进抗氧化产品的研发，制备符合国家标准的天然绿色有机肥.