小鼠碳酸二甲酯亚急性吸入毒性研究

乔千里 付志华 蔡功玉 叶荣军 康 凡 王学文 雷乾坤 陈烨韬 贺海波 许登清

(1. 中国石油化工股份有限公司 湖北化肥分公司， 湖北 宜昌 443200； 2. 三峡大学 生物与制药学院, 湖北 宜昌 443002)

乙二醇(ethylene glycol，EG)是一种广泛应用于精细化工、医药等领域的重要原料[1]。随着EG需求的日益增加，导致了EG产业的迅猛发展[2,3]。但是合成EG过程中会产生大量的碳酸二甲酯、氮氧化物等副产物，且它们多以气溶胶的形式存在于工作场所的空气中。自EG工业化生产以来，陆续有职业性急性中毒事故的报道[4,5]。近年来，职业性碳酸二甲酯亚急性中毒所致器官损伤成为关注焦点，但其毒性机制尚未完全阐明。碳酸二甲酯中毒主要以血液净化联合抗氧化应激、营养支持等对症治疗来减轻器官损伤。由于EG合成过程中的副产物碳酸二甲酯多以气溶胶形式存在于厂区的空气中，故迫切需要了解碳酸二甲酯对接触者可能造成的伤害，厂区空气中的容许浓度和职业接触限值标准，降低厂区中此类物质的方法等。在此基础上建立一套切实有效的防止碳酸二甲酯伤害的安全防护措施，以确保EG一线生产职工的生命安全。据此，本文对碳酸二甲酯小鼠亚急性吸入的毒性作用和靶器官进行研究，以便为EG生产过程中的职业防护提供指导。

1 材料与方法

1.1 药物

碳酸二甲酯由中国石油化工股份有限公司湖北化肥分公司提供，批号：20191027。

1.2 动物

SPF级雌雄各半的昆明小鼠(18～22 g)由三峡大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2017-0061，试验编号为2020037。实验小鼠饲养于SPF屏障系统中，待适应环境1周后进行毒性实验。实验研究按照《化学品毒性鉴定技术规范》(卫监督发[2005]272号)进行操作和评价，并被三峡大学伦理委员会批准和在其指导下进行。

1.3 试剂

血常规试剂购自拜耳医药。肌钙蛋白I(cTnI)购自南京建成，批号为：20200825。生化试剂：肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性和血糖(glucose，GLU)、总胆固醇(cholesterol，CHOL)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、总蛋白(total protein，TP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CREA)，购自北京利德曼，批号分别为：20200821、20200819、20200823、20200820、20200825、20200824、20200819、20200817、20200813、20200815、20200821。

1.4 仪器

电子体重秤(上海力衡)；电子天平(梅特勒-托利多)；生理记录仪(美国Biopac)；离心机(德国Eppendorf)；血细胞分析仪(美国雅培)；生化分析仪(德国Siemens)；酶标仪(瑞士Tecan)；显微镜(日本Nikcon)；切片机(奥地利莱卡)；脱水机、图像分析系统(德国Leica)。

1.5 方法

1.5.1 预实验

20只小鼠按照1∶0.8组间剂量比值随机分成4组，放入吸入染毒装置内(体积为97.5 L)吸入染毒。找出全部死亡的最小剂量(minimum dose for all deaths，Dm)及最大全不死剂量(maximum undead dose，Dn)。

1.5.2 正式实验

预实验测出碳酸二甲酯小鼠吸入染毒Dn为89.681 5 g，Dm为223.983 0 g，按照黄伟等[6]介绍的方法计算得组间r为0.80。实验除正常组外，染毒小鼠分设5个剂量组：碳酸二甲酯223.983 0 g剂量组、碳酸二甲酯179.186 4 g剂量组、碳酸二甲酯143.349 1 g剂量组、碳酸二甲酯114.6793 g剂量组和碳酸二甲酯91.743 4 g剂量组，每组20只，雌雄各半。实验动物给药前禁食12 h，不禁水。实验时依次将各组小鼠置于吸入染毒装置内(体积为97.5 L)，按照分组每次称取相应剂量的碳酸二甲酯晶体放入陶瓷蒸发皿内，关上染毒装置柜门；然后开启电磁加热器电源加热熔化、沸腾至完全挥发，然后依次开启循环风机、O2检测探头、温度监测探头，并实时监测染毒柜内O2浓度，通过鼓风机和抽风机，以保持染毒装置内所需的O2浓度。持续染毒2 h后将动物移至实验动物中心观察室内，观察小鼠一般状况。实验结束后，计算碳酸二甲酯的半数致死量(median lethal dose, LD50)及置信区间。

1.5.3 一般状况观察

观察动物的中毒表现、死亡数及死亡时间，进行心电图(electrocardiogram，ECG)检测、依次取血、脑、肺、心、肝、脾、胃、肾、大小肠、子宫、卵巢、睾丸等组织，观察上述脏器组织学病理变化。

1.5.4 ECG检测

小鼠吸入染毒碳酸二甲酯2 h后，记录实验小鼠ECG指标变化。

1.5.5 血液学指标检测

小鼠染毒7 d后，取血检测白细胞(white blood cells，WBC)、红细胞(red blood cells，RBC)、血红蛋白(hemoglobin，HGB)、血小板(platelets，PLT)、中性粒细胞(neutrophils，NEU)、淋巴细胞(lymphocytes，LYM)、嗜酸性粒细胞(eosinophagocytes，EOS)、嗜碱性粒细胞(basophilic granulocytes，BASO)、单核细胞(monocytes，MONO)。

1.5.6 血液生化指标检测

分离血清，进行心肌cTnI(胶乳增强免疫比浊法检测)、CK-MB(免疫抑制法检测)、LDH(比色法检测)、AST(比色法检测)、ALT(赖氏法检测)活性和TBIL(化学氧化法检测)、TP(比色法检测)、ALP(比色法检测)、CHOL(TCH酶法)、BUN(比色法检测)、CREA(肌氨酸氧化酶法)、GLU含量检测。

1.5.7 组织病理学HE染色

完成实验小鼠取血后，分别摘取脑、肺、心、肝、脾、胃、肾、大小肠、子宫、卵巢、睾丸等组织，称量上述脏器质量，计算脏器质量指数；然后观察上述脏器解剖学及镜下病理学变化。对出现病理学损伤的器官，每张组织切片镜下观察6个视野，对组织损伤的病变程度进行评分。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，以单因素方差分析进行多组间差异的比较，以Dunnett-t检验比较两组间均数的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 碳酸二甲酯吸入染毒后小鼠一般情况

吸入给药后，碳酸二甲酯223.983 0 g剂量组可观察到小鼠出现痉挛、烦躁不安等中毒反应，并在2 h内全部死亡；179.186 4 g剂量组和143.349 1 g剂量组吸入给药后也出现抽搐、烦躁不安等中毒反应，并在给药2 h后各死亡1只；吸入给药2 h内114.679 3 g剂量组可见上述中毒反应，但未出现小鼠死亡。给药剂量越大，死亡潜伏期越短，中毒症状越明显。未死亡小鼠也出现上述中毒反应，约1 h后恢复自主活动。用寇氏法计算得小鼠吸入染毒碳酸二甲酯的LD50为11.117 9×10-4g/cm3，95% CI为8.267 1×10-4～14.949 3×10-4g/cm3(见表1)。

表1 碳酸二甲酯吸入染毒后小鼠的情况观察(n=20)

2.2 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠ECG的影响

与正常组相比，碳酸二甲酯吸入染毒2 h后，小鼠ECG出现QRS波增宽、R-R间期延长和J点上移(均P<0.05或P<0.01)；碳酸二甲酯吸入染毒组小鼠心率相比正常组小鼠加快(均P<0.05或P<0.01)。实验结果表明，碳酸二甲酯吸入染毒早期可出现明显的ECG异常，而且随着碳酸二甲酯吸入染毒剂量增加ECG异常更为明显(见表2)。

表2 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠ECG的影响

2.3 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠心肌酶活性的影响

与正常组相比，碳酸二甲酯组小鼠血液中cTnI含量和LDH、CK-MB活性明显升高(均P<0.05或P<0.01)(见表3)。

表3 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠血液cTnI含量和LDH、CK-MB活性的影响

2.4 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠血液学指标的影响

与正常组相比，碳酸二甲酯组小鼠血液中RBC、PLT、NEU和HGB明显降低，而EOS、LYM、BASO、WBC、MONO明显升高(均P<0.05或P<0.01)。实验结果表明，碳酸二甲酯对实验小鼠血液学指标有明显的不良影响，而且随着吸入染毒剂量增加血液学指标异常更为严重(见表4)。

表4 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠血液学指标的影响

2.5 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠血液生化指标的影响

与正常组相比，碳酸二甲酯组小鼠血液中AST、ALT活性和BUN、TBIL、ALP、TP、CREA含量明显升高(均P<0.05或P<0.01)；而CHOL、GLU含量无明显改变(均P>0.05)。实验结果表明，碳酸二甲酯对实验小鼠血液生化指标有明显的不良影响，而且随着吸入染毒剂量增加，血液生化指标异常更为严重(见表5)。

表5 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠血液中生化指标的影响

2.6 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠脏器质量系数的影响

与正常组相比，碳酸二甲酯染毒组小鼠心、肺、肝、肾的脏器质量系数明显升高(均P<0.05或P<0.01)(见表6)。

表6 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠脏器质量系数的影响

2.7 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠肺组织形态学的影响

光镜下可见正常组小鼠肺泡上皮结构完整，肺泡形态均匀、纤毛排列整齐；碳酸二甲酯吸入染毒后可见小鼠肺泡和肺泡隔中大量炎性细胞浸润、肺泡隔增厚，毛细血管充血水肿(见图1)。根据肺损伤病理评分标准[7]，碳酸二甲酯吸入染毒组(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠肺组织损伤病理学评分分别为1.36±0.15、1.57±0.18、1.89±0.21、2.25±0.54和3.59±0.78分，明显高于正常组0.34±0.09分(均P<0.01)。实验结果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明显的肺损伤。

注：A：正常组；B：碳酸二甲酯91.743 4 g组；C：碳酸二甲酯114.679 3 g组；D：碳酸二甲酯143.349 1 g组；E：碳酸二甲酯179.186 4 g组；F：碳酸二甲酯223.983 0 g组；HE染色(×100)图1 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠肺组织形态学的影响

2.8 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠心脏组织形态学的影响

光镜下可见正常组小鼠心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐、结构清晰。碳酸二甲酯吸入染毒后可见心肌细胞凋亡坏死、心肌纤维排列紊乱、胞核破碎溶解，而且随着吸入染毒剂量增加其损伤更加明显(见图2)。根据心肌损伤病理评分标准[8]，碳酸二甲酯吸入染毒组(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠的心肌组织损伤病理学评分分别为0.64±0.09、1.03±0.13、1.14±0.23、1.29±0.27和1.48±0.21分，明显高于正常组0.00±0.00分(均P<0.01)。实验结果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明显的心肌损伤。

注：A：正常组；B：碳酸二甲酯91.743 4 g组；C：碳酸二甲酯114.679 3 g组；D：碳酸二甲酯143.349 1 g组；E：碳酸二甲酯179.186 4 g组；F：碳酸二甲酯223.983 0 g组；HE染色(×100)图2 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠心肌组织形态学的影响

2.9 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠肝组织形态学的影响

光镜下可见正常组小鼠肝细胞索围绕中央静脉呈放射状排列、肝血窦结构规整、胞核清晰完整；碳酸二甲酯吸入染毒后可见肝细胞排列紊乱、呈片状坏死、胞核破碎溶解，而且随着吸入染毒剂量增加其损伤更加明显(见图3)。根据肝脏损伤病理评分标准[9]，碳酸二甲酯吸入染毒组(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠肝组织损伤病理学评分分别为0.95±0.11、1.28±0.10、1.37±0.18、1.59±0.31和1.83±0.34分，明显高于正常组0.00±0.00分，(均P<0.01)。实验结果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明显的肝脏损伤。

注：A：正常组；B：碳酸二甲酯91.743 4 g组；C：碳酸二甲酯114.679 3 g组；D：碳酸二甲酯143.349 1 g组；E：碳酸二甲酯179.186 4 g组；F：碳酸二甲酯223.983 0 g组；HE染色(×100)图3 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠肝组织形态学的影响

2.10 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠小肠组织形态学的影响

光学显微镜下可见正常组小鼠肠上皮细胞结构完整、细胞间连接紧密、杯状细胞及腺体丰富；碳酸二甲酯吸入染毒后可见上皮细胞充血水肿、排列杂乱，杯状细胞及腺体减少，而且随着吸入染毒剂量增加其损伤更加明显(见图4)。根据小肠损伤病理评分标准[10]，碳酸二甲酯吸入染毒组(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠小肠组织损伤病理学评分分别为0.70±0.11、0.81±0.13、0.94±0.17、1.07±0.19和1.28±0.21分，明显高于正常组0.11±0.03分(均P<0.01)。实验结果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明显的小肠损伤。

注：A：正常组；B：碳酸二甲酯91.7434 g组；C：碳酸二甲酯114.679 3 g组；D：碳酸二甲酯143.349 1 g组；E：碳酸二甲酯179.186 4 g组；F：碳酸二甲酯223.983 0 g组；HE染色(×100)图4 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠小肠组织形态学的影响

2.11 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠肾脏组织形态学的影响

光镜下可见正常组小鼠肾小球结构完整，肾小管上皮细胞排列整齐、规则。碳酸二甲酯吸入染毒后可见肾小管上皮细胞排列紊乱、呈片状坏死、肾小球结构紊乱，而且随着吸入染毒剂量增加其损伤更加明显(见图5)。根据肾损伤病理评分标准[11]，碳酸二甲酯吸入染毒组(91.743 4 g、114.679 3 g、143.349 1 g、179.186 4 g和223.983 0 g)小鼠肾组织损伤病理学评分分别为1.15±0.13、1.37±0.18、1.66±0.19、2.05±0.35和3.44±0.41分，明显高于正常组0.00±0.00分(均P<0.01)。实验结果表明，小鼠吸入染毒碳酸二甲酯后可致明显的肾损伤。

注：A：正常组；B：碳酸二甲酯91.743 4 g组；C：碳酸二甲酯114.679 3 g组；D：碳酸二甲酯143.349 1 g组；E：碳酸二甲酯179.186 4 g组；F：碳酸二甲酯223.983 0 g组；HE染色(×100)图5 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠肾脏组织形态学的影响

2.12 碳酸二甲酯吸入染毒后对小鼠其他脏器组织形态学的影响

病理组织学检测结果表明，与正常组比较，碳酸二甲酯吸入染毒后，小鼠脑、胃、脾、肾上腺、睾丸、卵巢肉眼及镜检均无病理性改变。

3 讨论

EG工业化生产过程中的副产物碳酸二甲酯对人体刺激性主要体现在眼结膜、呼吸道、消化道、皮肤，而其他器官伤害则报道不一[12]。由于目前尚缺乏规范的安全防护措施，职业性急性碳酸二甲酯中毒伤害时有发生[13-15]。因此，迫切需要了解碳酸二甲酯在厂区空气中的容许浓度和职业接触限值标准、对一线生产职工的毒性作用和作用的靶器官等，在此基础上建立切实有效的安全防护措施。

众所周知，CK-MB和cTnI常作为临床诊断心肌损伤的重要标志物[16]。正常情况下，血液中CK-MB和cTnI活性较低；当心肌细胞遭受到物理、化学或生物性损伤时，胞浆内CK-MB和cTnI会释放入血液，使得血液中CK-MB和cTnI水平异常升高[17,18]。此外，当心肌预后不好时，血液中CK-MB和cTnI也会明显升高。因此，分析血液中CK-MB和cTnI水平可判断心肌损伤程度，评价药物的治疗效果[19,20]。在实验中我们发现，小鼠吸入染毒后血液中CK-MB和cTnI水平明显升高，此结果与ECG异常变化和心脏脏器系数升高，心肌凋亡坏死、心肌纤维排列紊乱、胞核破碎溶解的形态学损伤结果相一致。

ALT和AST是评估肝细胞损伤较为特异的指标之一[21]。当肝脏受到化学性等损伤时，肝细胞膜的通透性明显增加，原来存在于肝细胞胞浆内的ALT和AST迅速释放入血液，导致血液中ALT和AST水平明显升高[22,23]。此外，血液中的ALP、LDH在肝细胞受损时也会明显升高[24,25]。本研究结果显示，小鼠染毒后肝脏脏器系数，血液中ALT、AST、LDH、ALP活性明显高于正常组。提示碳酸二甲酯具有肝脏毒性，可导致肝细胞排列紊乱、呈片状坏死、胞核破碎溶解等器质性改变和肝功能受损。

BUN和CREA是人体蛋白质代谢的主要终末产物，主要通过肾脏排泄。当肾脏受到化学、生物等损伤时，会导致滤过能力下降，进而引起血液中BUN、CREA迅速升高[26,27]。因此，分析血液中BUN、CREA水平可判断肾脏损伤程度，预测治疗效果。在实验中，我们发现碳酸二甲酯吸入染毒小鼠的肾脏脏器系数、血液中BUN和CREA的含量均较正常组明显升高，提示碳酸二甲酯具有较强的肾脏毒性。肾脏组织形态学分析也进一步证实染毒后的小鼠肾脏肾小管上皮细胞排列紊乱、呈片状坏死、肾小球结构紊乱。此结果与Marchetti等[28]报道一致。

本研究还发现，碳酸二甲酯染毒后的小鼠小肠上皮细胞出现了充血水肿、排列杂乱，杯状细胞及腺体减少等病理性损伤，证实小肠也可能是其损伤的靶器官之一。此外，我们还发现血液中RBC、PLT、NEU、EOS、LYM、BASO、WBC、MONO和HGB较正常组均出现了异常改变，推测碳酸二甲酯可能也对血液系统造成损害。

综上所述，碳酸二甲酯吸入染毒具有较强的毒性，可引起实验小鼠ECG和血液学指标异常改变，可导致肺、心、肝、小肠和肾出现病理学改变。本研究为碳酸二甲酯的职业危害防治提供了实验依据。