IDO1在人肺腺癌组织的表达及其临床意义

陈宇晟 王 瑞 张 力 陈洪雷

(1.武汉大学基础医学院病理学教研室 武汉 430000；2.湖北省襄阳市中心医院重症医学科 襄阳 441000)

肺癌对我国乃至全球人类健康都构成了严重威胁，从2015到2020年底，仅仅5年时间，肺癌病例就累计达81.5万[1]，位居我国恶性肿瘤的首位，其5年生存率(11%～15%)较低的现状仍没有改变。肿瘤的免疫微环境在肿瘤的恶性进展中起着关键的作用。吲哚胺2，3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO1)可以促进色氨酸的分解，在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用[2]。IDO1与人肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)临床病理参数的关系，国内外报道鲜见，这也是本次研究的重点。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究共选取了120例独立的被确诊为肺腺癌患者的组织，并记录了患者详细的临床数据。所有患者的标本都是在接受放化疗之前的手术标本。利用2015年WHO确定的肺癌的组织学分类对这120例LUAD组织标本进行病理诊断和组织学分级。所有的标本都是由两名病理学家独立评估两次从而确认肺腺癌的诊断和组织学特征。通过国际抗癌联盟第8次修订的TNM(UICC 2017)进行更为具体的分期，101例患者(84.17%)分为I期，6例(5%)分为II期，4例(3.33%)分为III期，9例(7.5%)分为IV期。本研究遵照1964年《赫尔辛基宣言》和它们的后继条款以及相对应的道德规范来进行，同时获得了参与者和/或他们的知情法定监护人的同意。本实验满足武汉大学医学院医学伦理学委员会的有关规定并获得了批准。

1.2 实验方法

免疫组化检测IDO1的蛋白表达具体步骤如下：常规烤片、脱蜡和水化后，将组织完全浸泡在pH 9.0 EDTA中修复，使抗原充分被暴露出来，自然冷却后，ddH2O冲洗，TBST冲洗。封闭：甩去TBST，用免疫组化笔画圈，滴加封闭液孵育20min；滴加一抗：滴加稀释后的一抗(IDO1 1∶100稀释，美国CST公司抗体)，4℃孵育过夜；取出后恢复室温，TBST洗2min ×3次；滴加HRP标记的二抗：在37℃孵育1h后，TBST 缓冲液洗2min ×3次；显微镜观察DAB显色情况，在合适的时候用蒸馏水冲洗终止显色；TBST 缓冲液洗涤3×2min；苏木素染核10s，盐酸酒精分化液10s；最后常规脱水透明封片，显微镜下观察结果并成像。

1.3 免疫组化染色结果的判定

IDO定位于细胞的胞质和胞膜，用染色阳性区域(Positive area，AP)、染色强度(Staining intensity，IS)半定量的法则来观察，并对IDO1的表达情况进行分析打分。AP评分标准有：0(AP:0%～5%)，1(AP:5%～25%)，2(AP:26%～50%)，3(AP:51%～75%)和4(AP:>75%)，IS被分为0(阴性)，1(弱)，2(中等)，3(强)。IDO1表达计算：强度分布(Intensity distribution，ID)=阳性区域(AP)×染色强度(IS)[3]，采用使用者工作特性曲线(ROC)确定IDO1表达的最佳截点，根据最佳灵敏度和最佳特异度确定的ROC曲线IDO1在肿瘤细胞中的最佳截点为2.0(≥2.0=高表达；<2.0=低表达)。

1.4 统计学方法

本研究采用SPSS26.0软件进行统计学分析和计算，采用独立样本χ2检验和精确概率法分析IDO1蛋白与临床病理参数的关系。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

本研究使用了免疫组织化学技术检测120例肺腺癌患者的IDO1蛋白的表达情况，本研究结果表明，IDO1在大多数人肺腺癌亚型中广泛表达，并且具有明确的空间分布特征。其中在乳头状为主、腺泡状为主还有实性为主的肺腺癌中高表达，但在贴壁细胞为主型的LUAD中低表达。不仅观察到IDO1在肿瘤细胞的胞质和胞膜上广泛表达，也观察到免疫细胞、成纤维细胞、癌旁异型增生的支气管上皮细胞中也有IDO1的存在，但在正常支气管上皮细胞呈阴性表达。根据诊断阈值，在肺腺癌组织中，IDO1高表达于40%(48/120)肺腺癌患者中，与正常肺组织相比，差异有统计学意义。为了探索LUAD患者中IDO1的表达与临床病理特征的关系(表1)，本研究采用χ2检验进行分析，结果发现肿瘤细胞中IDO1的表达与性别(P=0.006)淋巴结转移(P=0.011)有统计学意义的关联，而与其他临床病理参数均无关(P>0.05)。

表1 IDO1蛋白表达与LUAD患者临床病理参数的关系

3 讨论

目前，以免疫微环境的干预为核心的免疫治疗策略已经在临床上得到应用，并且成为了NSCLC治疗的热点[4]。最近批准了多种治疗性抗体用于NSCLC的治疗，关于阻断这些免疫检查点通道药物的最佳使用仍然存在许多问题。最近的临床进展发现了IDO1在肿瘤发生中的重要作用，这提示IDO1将指导未来的生物标志物发现策略[5]。IDO1在色氨酸代谢中起到了关键性的作用，它通过将必需的氨基酸-色氨酸代谢成球蛋白来产生其生物学效应[6]。IDO1既能下调T细胞的功能和表达水平，又可助于促进肿瘤的血管形成。

本研究通过免疫组织化学技术研究了120例LUAD患者中IDO1蛋白的表达情况以及临床病理意义。本研究发现，在大多数LUAD队列中，IDO1在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织，且差异具有统计学意义；并且发现在部分异常增生的支气管上皮，发现IDO1的高表达，而正常支气管上皮细胞均呈阴性表达，据此可推测IDO1与LUAD的发生有关。本研究发现IDO1在癌巢外围表达比肿瘤细胞内部信号更强，这或许与淋巴细胞浸润有关。同时，通过研究发现，IDO1在不同的组织学亚型中表达强度并不相同，在浸润性腺癌中如腺泡型、乳头型、实体型，IDO1高表达，但在贴壁为主的微浸润肺腺癌患者中IDO1低表达，并且与LUAD的淋巴结转移显著相关，所以由此推测IDO1的表达与肺腺癌的进展有关。本研究还发现IDO1的高表达主要见于男性LUAD患者，可能与吸烟有关。与以往的研究不同的是[7]，IDO1高表达只占40%(48/120)，推测这可能与所选择病例的临床TNM分期有关，因为本研究选择的病例大多数都是I,II期的肺腺癌患者，所以可能导致检测到IDO1高表达阳性率不高。

综上所述，本研究结果表明：IDO1蛋白的高表达与LUAD的发生发展密切相关，作为色氨酸代谢第一步的限速酶，故推测靶向IDO1有可能为LUAD的肿瘤免疫治疗打开新的窗口。