HCV感染患者血清miR-199和miR-483水平表达及其临床价值

王楷翔，曹 明，陈 晖，赵 娟

（1.保定市人民医院a.分子生物学实验室；b.肝病科，河北保定 071000；2.保定市第二中心医院检验科，河北涿州 072750）

丙型肝炎病毒（hpatitis C virus,HCV）可导致慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C,CHC）、肝硬化，部分患者发展为肝癌，是全球范围内重大的公共卫生问题[1-2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类高度保守的非编码RNA，其在丙型肝炎中存在异常表达，可能在丙型肝炎的发病机制中发挥着重要的作用[3-4]。近期的研究指出，miR-199 及miR-483 表达水平与HCV 所致的相关肝炎有关，在肝脏疾病的发病机制和进展中起着重要作用，是诊断和监测肝脏疾病进展的潜在无创生物标志物[5-6]。为此，本研究通过检测血清miR-199 及miR-483 水平在HCV 感染肝病患者中的表达情况，分析miR-199 及miR-483 对肝癌的诊断价值，旨在为该病的诊疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取保定市人民医院2018年1月～2020年12月收治的121 例HCV 感染患者，其中男性70 例，女性51 例，年龄28 ～68（49.25±9.70）岁。121 例HCV 感染患者中慢性丙型肝炎50 例，肝硬化43 例，肝癌28 例。纳入标准：CHC 的诊断参考《丙型肝炎防治指南》[7]；排除标准：存在其他类型肝病及感染性疾病。另设计对照组50 例为体检正常者，其中男性27 例，女性23 例，年龄30 ～65（48.60±9.35）岁。各组年龄、性别比较差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 仪器与试剂 SLAN96P 型荧光定量PCR 仪（上海宏石公司），PCR 试剂盒、RNeasy 试剂盒、miRNA Easy 试剂盒和Trizol 试剂盒均购自上海生工生物工程公司，贝克曼Au680 全自动生化分析仪。

1.3 方法

1.3.1 丙肝病毒载量（hepatitis C virus-RNA，HCV-RNA）检测：所有研究对象在治疗前采集静脉血5ml，离心分离血清，HCV-RNA 载量使用荧光定量PCR 仪检测。

1.3.2 miR-199 及miR-483 检测：使用荧光定量PCR 仪检测miR-199 及miR-483，反应体系为20 μl：10μl TaqMan 通用混合物溶液（2×），1μl引物及探针Mix（20×），1.33 μl 反向转录脱氧核糖核酸，7.67μl 双蒸水。采用2-△△Ct法计算miR-199 及miR-483 水平。

1.3.3 相关检测：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平采用贝克曼Au680 全自动生化分析仪及配套试剂检测。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。应用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析miR-199 及miR-483 诊断肝癌的价值。相关性分析采用Pearson 相关。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组ALT，AST 及HCV-RNA 水平比较 见表1。肝癌组、肝硬化组和CHC 组ALT 及AST 水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（t=12.316,10.972,9.625,13.417,11.805,10.611,均P<0.001）。各组间HCV-RNA比较，差异无统计学意义（t=0.715,0.924,0.583,均P>0.05）。

表1 各组ALT，AST 及HCV-RNA 水平比较

2.2 各组血清miR-199 及miR-483 表达水平比较 见表2。与对照组比较，肝癌组、肝硬化组和CHC组血清miR-199 及miR-483 表达水平均明显升高，差异有统计学意义（t=14.704，12.151，11.904，16.825，13.512，13.106， 均P<0.001）； 且血清miR-199 及miR-483 表达水平在肝癌组均明显高于CHC 组和肝硬化组，差异有统计学意义（t=12.553，11.604，14.817，13.216，均P<0.001）。

表2 各组血清miR-199 及miR-483 表达水平比较（±s）

表2 各组血清miR-199 及miR-483 表达水平比较（±s）

项目对照组（n=50）CHC 组（n=50）肝硬化组（n=43）肝癌组（n=28）FP miR-1990.80±0.141.70±0.651.83±0.723.40±1.2515.736<0.001 miR-4830.71±0.081.93±0.822.04±0.913.86±1.6218.227<0.001

2.3 miR-199 及miR-483 诊断肝癌的价值 见表3和图1。miR-199 及miR-483 诊断肝癌的最佳截断值为2.28 和2.53，二者联合诊断肝癌的曲线下面积（0.922，95%CI ：0.858～0.977）最大，明显高于单项miR-199（0.811，95%CI：0.753～0.870）及miR-483（0.850，95%CI：0.788～0.912），差异有统计学意义（t=6.270，5.812，均P<0.05），其敏感度和特异度为93.7%和86.4%。

图1 miR-199 及miR-483 诊断肝癌的ROC 曲线

表3 miR-199 及miR-483 诊断肝癌的价值

2.4 miR-19 与miR-483 的相关性分析 见图2。Pearson 相关分析显示，CHC 组血清miR-199 表达水平与miR-483 呈正相关（r=0.725，P<0.001），肝癌组血清miR-199 表达水平与miR-483 呈正相关（r=0.803，P<0.001）。

图2 血清miR-199 表达水平与miR-483 的相关性

3 讨论

miRNA 作为基因表达的转录后调节因子，在丙型肝炎的发生发展中发挥了重要的作用[8]。国内外研究表明，miRNA 具有调节肝脏的生理和病理功能，其表达改变与肝脏代谢失调、肝损伤、肝纤维化和肿瘤的发生发展有关，使得miRNA 成为诊断和治疗肝脏疾病的重要策略，未来可能是肝癌诊断、治疗和预后判断的无创性生物标志物[9-10]。ELHEFNY 等[11]研究发现，miR-199 异常表达与肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡有关，可能在肝脏疾病的进展中发挥潜在作用，是诊断和监测肝脏疾病进展一个有用的生物标志物。TANG 等[12]研究认为，miR-483与肝癌的发生有关，在肝癌细胞增殖、迁移、侵袭中发挥促进作用，其高表达是肝癌患者生存期缩短的独立预测因子，可作为肝癌的诊断和预后评估的潜在标志物。

本研究显示，与对照组比较，肝癌组、肝硬化组和CHC 组血清miR-199 及miR-483 表达水平均明显升高，且肝癌组血清miR-199 及miR-483 表达水平升高最明显。提示miR-199 及miR-483 高表达促进了病情进展，其在丙型肝炎的发展过程中具有一定的促进作用。有研究指出，miRNA 在HCV 感染过程中参与了病毒复制，这些miRNA 可以直接靶向HCV 基因组参与调控丙型肝炎的发病，与肝细胞癌的发生和发展有关[13]。LU 等[14]研究显示，miR-483 在肝癌组织中显著上调，并能显著促进肝癌细胞在体外的迁移和侵袭，是肝癌侵袭转移的重要调控因子和复发的独立危险因素，可作为评估肝癌复发风险的生物标志物。肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都很高,寻找新的、可靠的、无创的生物标志物对提高肝癌的早期诊断具有重要意义。本研究ROC 曲线显示，miR-199 及miR-483二者联合诊断肝癌的曲线下面积最大，其敏感度为93.7%，特异度为86.4%，相关分析结果也显示，肝癌组miR-199 与miR-483 呈显著正相关。这说明miR-199 及miR-483 二者联合检测有助于提高肝癌诊断的价值，有望作为肝癌诊断的生物学指标。JIAO 等[15]研究发现，miR-199 是反映肝损伤的一种新的生物标志物，与肝功能密切相关，对评估肝癌患者预后和反映治疗效果具有很好的价值。另有研究表明，miR-483 表达水平在肝癌的不同生物学过程中起着重要作用，其在肝癌患者中的表达水平高于肝硬化患者，可作为诊断HCV 感染后肝癌患者的潜在生物标志物[16]。

综上所述，血清miR-199 及miR-483 水平在HCV 感染患者中明显升高，而且在肝癌患者中升高最明显，miR-199 及miR-483 二者联合检测有助于提高肝癌诊断的价值，可能是肝癌治疗的潜在靶向。