镇宁小黄姜姜酚提取工艺优化及其抗氧化活性研究

徐菁，刘晓燕,2*，郭银萍，穆兴燕

(1.贵阳学院 食品与制药工程学院，贵阳 550005；2.贵州省果品加工技术研究中心，贵阳 550005)

小黄姜(GlobbaracemosaSmith)，姜科姜属植物，其切面纯黄色，味辛辣浓，肉细嫩，味香，纤维较细[1]，具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖和心血管保护活性[2]，是一种传统的药食两用植物。生姜中含有的有效成分很多，结构较复杂，目前已鉴定出来的成分已经达到100多种，主要可以分为挥发油、姜酚和二苯基三大类[3]。姜的辛辣味道归因于姜酚(GNS)的存在，GNS是一组挥发性酚类化合物，对人体健康和营养有重要贡献[4-5]，具有多种生物活性，从抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎、抗过敏到各种中枢神经系统活性[6]。

姜酚的提取主要采用传统的费时费力的方法，如超临界CO2萃取法、微波提取法、溶剂提取法等，提取过程中会产生大量的污染物，有机溶剂浪费。鉴于此，寻找更高效、更节能的提取方法迫在眉睫，生物酶解提取法是一种较新的方法，生物酶解提取法是指在传统提取方法的基础上，采用酶类酶解细胞壁及间质中的纤维素等物质[7]，其中纤维素酶能高效地对植物细胞壁组分进行酶解，促进细胞壁内有效成分的释放[8]。超声波提取法主要利用超声波的空化、机械和热效应加速有效成分的溶出[9-10]，二者相辅相成的促进作用显著提高了提取效率，鉴于此，本课题采用纤维素酶与超声结合法提取小黄姜中的姜酚，采用正交试验优化小黄姜姜酚的提取条件，并进行抗氧化活性研究，姜酚是生姜中的主要活性成分，所以本文旨在为姜酚有效成分的提取提供新途径，为姜酚深加工技术的发展提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

小黄姜：购自贵州省安顺市镇宁县黔棠姜生物科技有限公司。经清洗、切片、液氮速冻，小型粉碎机粉碎，装盘，放入真空冷冻干燥机中冻干，冻干条件0.1 kPa，冻干时间18 h，冻干粉取出后用自封袋装好放置于干燥器中保存备用。

1.1.2 试剂

纤维素酶(绿色木霉，50 U/mg，Lot：H31A11S122948)：上海源叶生物科技有限公司；香兰素(香草醛，分析纯AR)：天津市科密欧化学试剂有限公司；柠檬酸-水、柠檬酸钠：大自然生物集团有限公司；乙醇(100%，分析纯AR)：天津康耐珂德科技发展有限公司。

1.1.3 主要仪器

CS-2001-02粉碎机 永康市天棋盛世工贸有限公司；BILKON-FD5BD真空冷冻干燥机 上海比朗仪器制造有限公司；FAB1243分析天平 上海良平仪器仪表有限公司；TDZ5-WS高速离心机 湖南平凡科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 小黄姜中姜酚的提取工艺

小黄姜→清洗→液氮速冻→粉碎→冷冻干燥→纤维素酶处理→超声处理→离心→测定。

1.2.2 香草醛标准溶液的配制

精确称取香草醛标准品0.5 g，移入100 mL容量瓶中用无水乙醇定容、摇匀，再精确吸取5 mL，移入100 mL容量瓶中用无水乙醇定容，得0.25 mg/mL香草醛标准溶液，备用。

1.2.3 测定条件的选择

姜酚目前没有固定标品，因香草醛与姜酚的母核结构相似，故本文选用香草醛作为对照标准[11]。以无水乙醇作为空白对照，将香草醛的无水乙醇溶液及姜酚的无水乙醇提取液进行紫外波长扫描，扫描波长范围在200～400 nm，紫外吸收曲线见图1。由紫外吸收曲线可知，香草醛和小黄姜的乙醇粗提液都在280 nm处有显著的吸收波长。

图1 无水乙醇姜酚粗提液(a)和无水乙醇香草醛溶液(b)Fig.1 The anhydrous ethanol gingerol crude extract (a) and anhydrous ethanol vanillin solution (b)

1.2.4 香草醛标准曲线制备

参考刘军伟等[12]的方法，稍作调整。配制质量浓度为250 μg/mL的香草醛标准溶液，准确吸取香草醛标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分别置于10 mL棕色容量瓶中[13]，用无水乙醇定容到刻度线，涡旋混合均匀。空白对照为乙醇(100%)，检测波长为280 nm，测定其吸光度值。

由图2可知，y轴表示测定的吸光度值A，x轴表示浓度(μg/mL)，标准曲线的回归方程为y=0.0624x-0.1266，相关系数R2=0.998，线性关系良好。

图2 香草醛标准曲线Fig.2 The standard curve of vanillin

1.2.5 姜酚的提取

精确称取小黄姜冷冻干燥粉1 g，按照料液比1∶20(g/mL)加入20 mL pH 5的缓冲溶液，添加0.04 g纤维素酶，在水浴锅温度50 ℃下酶解1 h后，96 ℃灭酶3.5 min。加入20 mL无水乙醇，在200 W超声功率下超声30 min，在转速2500 r/min下离心10 min后取上清液1 mL定容至10 mL，在280 nm处测其吸光度值。根据标准曲线，计算相应的含量：

姜酚=(2.001V0V1C)/(V2W×106)×100%。

式中：2.001为香草醛换算成姜酚的系数；V0为样品提取液总体积(mL)；V1为测定样液总体积(mL)；C为香草醛浓度(μg/mL，回归方程中求出)；V2为测定的样品溶液体积(mL)；W为称取的样品量(g)。

1.2.6 单因素试验设计

1.2.6.1 料液比的选择

在固定条件：超声功率、时间、温度分别为250 W、30 min、50 ℃，酶添加量0.03 g、pH 5、酶解温度50 ℃、酶解时间60 min下，考察其料液比为1∶0、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL )时对姜酚提取率的影响。

1.2.6.2 酶添加量的选择

在固定条件：超声功率、时间、温度分别为250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶解温度50 ℃、酶解时间60 min下，考察酶添加量分别为0.01，0.03，0.05，0.07，0.09 g时对姜酚提取率的影响。

1.2.6.3 酶解温度的选择

在固定条件：超声功率、时间、温度分别为250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g、酶解时间60 min下，以30，40，50，60，70 ℃作为酶解温度考察指标，探究不同酶解温度对姜酚提取率的影响。

1.2.6.4 酶解时间的选择

在固定条件：超声功率、时间、温度分别为250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g，酶解温度50 ℃下，以20，40，60，80，100 min作为酶解时间考察指标，探究不同酶解时间对姜酚提取率的影响。

1.2.6.5 pH的选择

在固定条件：超声功率、时间、温度分别为250 W、30 min、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、酶添加量0.05 g、酶解温度50 ℃、酶解时间40 min，以3，4，5，6，7作为pH考察指标，探究不同pH对姜酚提取率的影响。

1.2.6.6 超声时间

在固定条件：超声功率、温度分别为250 W、50 ℃，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.03 g、酶解温度50 ℃、酶解时间40 min，以10，20，30，40，50 min作为超声时间考察指标，探究不同超声时间对姜酚提取率的影响。

1.2.6.7 超声温度

在固定条件：超声功率、时间分别为250 W、30 min，料液比1∶20(g/mL)、pH 5、酶添加量0.05 g、酶解温度50 ℃、酶解时间40 min，以20，30，40，50，60 ℃作为超声温度考察指标，探究不同超声温度对姜酚提取率的影响。

1.2.7 P-B试验设计

P-B简称爬坡试验，是从多个单因素中筛选出对试验影响最大的单因素的方法[14]。主要是对单因素中每个因子取(+1)和(-1)两水平进行分析，通过比较各个因子(+1)和(-1)的差异与整体的差异来确定因子的显著性。通过 P-B试验对7个单因素的筛选，能够减少在后面的优化试验中由于因素太多或部分因子不显著而耽误试验进度和影响试验结果[15]。

本试验采用N=12的试验设计，对影响小黄姜姜酚提取率的7个因素料液比(A)、酶添加量(B)、酶解温度(C)、酶解时间(D)、pH(E)、超声时间(F)、超声温度(G)进行筛选。每个因素取高(+1) 、低(-1)两个水平，以提取率作为响应值(Y)，其取值见表1。

表1 P-B试验设计因素水平取值Table 1 The factors and levels of P-B test design

1.2.8 正交试验设计

在单因素和P-B试验的基础上，对影响小黄姜姜酚提取率的4个显著影响因素: pH(E)、料液比(A)、酶解温度(C)和超声温度(G)，设计L9(34)正交试验，以此确定最佳提取条件。正交试验因素与水平表见表2。

表2 正交试验因素与水平Table 2 The factors and levels of orthogonal test

1.2.9 姜酚粗提物抗氧化活性研究

1.2.9.1 DPPH自由基清除能力的测定

参考巫永华等[16]的方法，稍作改动，用乙醇(100%)配制DPPH乙醇溶液1 mmol/L，用乙醇(100%)分别配制姜酚粗提液(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12 mg/mL)。分别取2.0 mL姜酚粗提液、DPPH自由基溶液(1.2 mmol/L)涡旋35 s，混合均匀，暗处放置 30 min，以乙醇(100%)作参照，测定吸光值 A；2.0 mL 粗提液、95%乙醇混合后测定的吸光值为A0；2.0 mL乙醇(100%)+2 mL DPPH溶液混合后测定的吸光值为A1。以上吸光度均在517 nm处测定，以同浓度的Vc作阴性对照，清除率计算公式为：

清除率=[1-(A-A0)/A1]×100%。

1.2.9.2 ABTS 自由基清除能力的测定

参照艾薇等[17]的方法,稍作改动，取ABTS 自由基溶液(6.6 mmol/L)和K2S2O8溶液(3.2 mmol/L)等体积混匀，避光放置17～22 h，将ABTS 自由基溶液用乙醇(100%)进行稀释，直至吸光度为0.70±0.02。取 0.2 mL样品液+3.8 mL ABTS自由基溶液，在波长为734 nm下测定吸光值A，同时将0.2 mL乙醇(100%)+3.8 mL ABTS溶液混合后测定其吸光值 A1，以及样品溶液+乙醇(100%)混合后的吸光值A0，以同浓度的Vc作阴性对照，清除率计算公式为：

清除率=[1-(A-A0)/A1]×100%。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图3中(1)可知，在料液比1∶10～1∶50 (g/mL)范围内，当溶剂在10～20 mL时提取率随着料液比的升高而升高，当溶剂在20～30 mL时提取率下降幅度较大，之后随着溶剂的增加提取率逐渐降低，这是由于溶剂占比增加导致酶的浓度降低，从而降低了酶与底物的接触概率；同时也会导致其他杂质的溶出[18]，从而降低了小黄姜姜酚提取率，因此料液比选择1∶20(g/mL)最适宜。

图3 单因素对小黄姜姜酚提取率的影响Fig.3 The single factor on the extraction rate of gingerol from Globba racemosa Smith

由图3中(2)可知，在酶添加量0.01～0.09 g范围内，酶添加量在0.01～0.05 g时提取率随着添加量的增加而升高，0.05 g时达到最大提取率，之后提取率逐渐下降，再增加酶添加量对提取率影响不大。这是因为随着酶添加量的增加，反应逐渐趋于完全，当达到最大添加量时，没有足够底物与之接触，导致酶的作用受到抑制[19]，因此酶的添加量定为0.05 g最恰当。

由图3中(3)可知，在酶解温度30～70 ℃范围内，随着温度的上升，姜酚提取率也逐渐升高，温度升高到50 ℃时姜酚提取率达到最大值，随后姜酚提取率大幅度下降，再提高酶解温度对提取率影响不大，这是由于酶作用有其最适温度，超过最适温度后，随着温度的升高，酶活性会降低[20]，因此酶解温度定为50 ℃最恰当。

由图3中(4)可知，在酶解时间20～100 min范围内，20～40 min姜酚提取率大幅度上升，40 min以后提取率逐渐下降，这是因为随着时间的增加，溶出杂质逐渐增多，导致提取率下降，因此酶解时间定为40 min最合适。

由图3中(5)可知，当pH达到5时提取率达到最大值，之后再增加pH对提取率的影响不大，酶在最适pH范围内酶活力比较大，能最大程度发挥其作用，超过此范围酶会失活，因此pH 5时最恰当。

由图3中(6)可知，当超声时间达到30 min时提取率达到最大值[21]，之后随着超声时间的增加，对提取率的影响不大，超声具有较强的机械效应，短时间内有利于姜酚的溶出，长时间的作用会破坏姜酚而使姜酚有损失，因此超声时间为30 min时最恰当。

由图3中(7)可知，随着超声温度的增大，提取率逐渐升高，温度升高到40 ℃时提取率达到最大值，随后随着温度的增大，提取率大幅度下降。姜酚由于含量较少，稳定性较差，容易受到高温影响而导致含量减少，因此超声温度为40 ℃时最恰当。

2.2 P-B试验

P-B试验设计结果见表 3，通过对表3中的试验数据进行分析，结果见表4。

表3 P-B试验设计及结果Table 3 P-B test design and corresponding results

续 表

表4 P-B试验设计回归分析结果Table 4 Regression analysis results of P-B test design

由表4可知各因素是否有统计意义，T检验显示：因素G回归系数不为0的假设成立，T=3.21，P=0.033<0.05，有统计意义。同理因素A，C，E有统计意义，可以认为pH(E)、料液比(A)、酶解温度(C)和超声温度(G)这4个因素对试验结果具有显著影响，由图4可知，标准化效应的Pareto图从上到下顺序对应A～G 7个因素对试验结果Y的重要程度，标准化效应超过竖线(>2.78)对应的因素是显著影响因素。

图4 标准化效应的Pareto图Fig.4 The Pareto diagram of standardized effect

2.3 正交试验结果

依据单因素的试验结果，以小黄姜姜酚提取率为评价指标，采用L9(34)正交设计，选择A，C，E，G 4个因素，确定最佳提取条件的正交试验结果与分析(见表5)，方差分析结果见表6。

表5 提取条件优化正交试验结果与分析Table 5 The results of analysis of orthogonal test for optimization of extraction conditions

表6 正交试验结果方差分析Table 6 The variance analysis of orthogonal test results

由表5可知，由极差R的大小可知，影响提取率最大的因素是A(料液比)，其次是C(酶解温度)，再次是E(pH)，最小的是G(超声温度)，其影响提取率由大到小排序为A>C>E>G。提取小黄姜姜酚最优的条件为A1C2E3G3，即按照料液比1∶10(g/mL)，pH 6，酶解温度50 ℃，超声温度50 ℃。在此最佳提取条件下，小黄姜姜酚提取率为1.917%。

2.4 姜酚抗氧化活性研究

2.4.1 姜酚对DPPH的清除能力

由图5可知，对照组VC和姜酚均对DPPH自由基表现出了清除能力。姜酚对DPPH的清除率随着浓度的增加而升高，当浓度超过0.08 mg/mL 时，清除率的上升趋势有所减缓。VC在试验浓度范围内，清除率均在90%以上[22]，总体来说，超声波-纤维素酶法辅助乙醇提取的小黄姜姜酚粗提物具有良好的清除活性。

图5 姜酚粗提物及Vc对DPPH自由基清除率的影响Fig.5 The effect of gingerol crude extract and Vc on scavenging rate of DPPH free radical

2.4.2 姜酚对ABTS的清除能力

由图6可知，对照组Vc和姜酚粗提物对ABTS自由基均具有清除能力。姜酚粗提物对ABTS自由基的清除率随着浓度的升高而变大，且各个浓度间的差异都表现出显著性[23]，最大浓度的清除率达到67.44%。总体来说，超声波-纤维素酶法辅助乙醇提取的小黄姜姜酚粗提物具有良好的清除活性。

图6 姜酚粗提物及Vc对ABTS自由基清除率的影响Fig.6 The effect of gingerol crude extract and Vc on scavenging rate of ABTS free radical

3 结论

对小黄姜进行了纤维素酶-超声波辅助法提取的研究，在单因素试验和Plackett-Burman 试验基础上，设计正交试验对提取条件进行了优化，优化后的提取条件为：料液比1∶10(g/mL)，pH 6，酶添加量0.05 g，酶解时间40 min，酶解温度50 ℃，超声时间30 min，超声温度50 ℃，测得小黄姜姜酚的提取率为1.917%，超声波辅助结合纤维素酶解提取法结合了两种提取方法的优点，利用二者相辅相成的促进作用显著提高了小黄姜姜酚提取率，具有提取时间短、条件温和、提取率高等优点，为小黄姜中有效成分的提取提供了新途径，在抗氧化试验中，随着姜酚粗提液浓度的增加，姜酚粗提物对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率始终略低于Vc，这表明姜酚粗提物对ABTS自由基具有较好的清除能力。