基于GEO数据库数据肝内胆管癌吉西他滨耐药基因筛选及生物学功能分析

梁子豪，高雅楠，史丽云

南京中医药大学医学院整合医学学院，南京210000

肝内胆管癌是继肝细胞癌之后第二常见的原发性肝恶性肿瘤，在中国的发病率较高，且在亚洲范围内发病率呈上升趋势［1］。因其早期发现困难，大部分患者发现后已处于中晚期［2］，患者接受手术治疗后五年生存率不到20%，即使切除充分，仍有超过50%的患者在切除后的第1年或第2年出现肿瘤复发［3］。所以，化疗仍然是重要的治疗手段，可以有效改善术后生存时间，提高患者的生存质量。目前，肝内胆管癌一线的化疗药以吉西他滨为主，但临床发现有部分患者接受治疗后出现耐药现象［4］，目前肝内胆管癌吉西他滨耐药的机制仍未明确。我们利用公共数据库中的数据信息，采用生物信息学技术筛选出肝内胆管癌吉西他滨耐药基因，分析了吉西他滨耐药基因的生物学功能及相关信号通路；并探讨了关键耐药基因（MCC值排名前十）与肝内胆管癌预后的关系，为探讨肝内胆管癌耐吉西他滨的机制提供新的线索，也为临床联合用药提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 数据来源从NCBI的GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）［5］获得了肝内胆管癌耐药基因表达数据，其中MT-CHC01_rep1、MTCHC01_rep2为肝内胆管癌吉西他滨敏感株、MTCHC01R1.5_rep1、MT-CHC01R1.5_rep2为 肝 内 胆管癌吉西他滨耐药株。检测平台为GPL6480。

1.2 肝内胆管癌吉西他滨耐药基因的筛选利用在线网络工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/）筛选吉西他滨耐药和吉西他滨敏感的肝内胆管癌细胞系间差异表达基因（DEGs，肝内胆管癌吉西他滨耐药基因，简写为吉西他滨耐药基因）。以P值＜0.05，|log（Foldchange）|＞2获取差异表达基因，log（Foldchange）＞2为显著性上调基因，log（Fold change）＜2为显著性下调基因。

1.3 吉西他滨耐药基因生物学功能及信号通路分析通过DAIVD数据库对吉西他滨耐药基因进行GO和KEGG功能富集分析。GO分析中包括细胞成分（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF）项［6］，P值＜0.05为有统计学意义，绘制条形图及气泡图。

1.4 吉西他滨耐药基因中的关键基因筛选及与肝内胆管癌发生、预后的关系使用STRING数据库对差异化基因进行分析同时构建蛋白质—蛋白质互作网络图，同时运用Cytoscape软件中的cytohubba插件来筛选关键基因［7］。筛选条件为MCC值排名前十。

通过GEPIA箱形图分析研究了36个胆管癌组织样品和9个正常组织样品中关键基因的表达水平。以P值＜0.05为有显著性差异。基于TCGA-COAD（The Cancer Genome Atlas-colon adenocarcinoma）和TCGA-READ（The Cancer Genome Atlas-rectum ade‑nocarcinoma）数据集、利用GEPIA工具分析关键基因与肝内胆管癌预后的关系。筛选标准：Group Cut‑off：Median，Cutoff-High（%）：50，Cutoff-Low（%）：50。

2 结果

2.1 肝内胆管癌吉西他滨耐药基因共鉴定出肝内胆管癌吉西他滨耐药基因589个，上调314个，下调275个。火山图见图1。

图1 耐药基因火山图

2.2 吉西他滨耐药基因的生物学功能上调吉西他滨耐药基因富集于BP 40条，CC 34条，MF 36条。下调吉西他滨耐药基因富集于BP 24条，CC 17条，MF 16条。在生物学过程中，上调吉西他滨耐药基因主要参与DNA复制、修复，以及细胞有丝分裂等过程；富集于细胞核中；影响组蛋白结合、蛋白结合、DNA结合、蛋白质二聚体结合和染色质结合等生物学功能。下调吉西他滨耐药基因则主要参与血管生成、低氧应答、线粒体自噬、自噬体组装和骨骼肌细胞分化过程；主要分布在外泌体，细胞质和细胞外空隙；影响血红素结合、电压门控离子通道、肝素结合、氧化还原酶和类固醇激素受体活性等生物学功能。在KEGG富集分析中，上调吉西他滨耐药基因主要富集在DNA复制、细胞周期、嘌呤嘧啶代谢、错配修复、核苷酸切除修复、碱基切除修复和酪氨酸代谢相关通路；下调吉西他滨耐药基因则主要富集于谷氨酸能、γ-氨基丁酸能通路和Rap1信号通路。

2.3 关键基因及其与肝内胆管癌发生、预后的关系上调吉西他滨耐药基因中的关键基因为MCM3、细胞分裂蛋白45（（CDC45）、微小染色体维持蛋白2（MCM2）、CDC6、MCM4、FEN1、微小染色体维持蛋白6（MCM6）、PCNA、EXO1和WDHD1。相比正常组织，肿瘤组织中的MCM2，MCM6，CDC45均高表达（P均＜0.05），而ATF3无统计学意义。

下调吉西他滨耐药基因中的关键基因为VEG‑FA、FOS、EGR1、DUSP1、ITGB1、ATF3、GABARA‑PL1、FOSB、MAP1LC3A、ULK1。其中上调的关键基因中的CDC45、MCM2、MCM6高表达的肝内胆管癌患者生存率低，下调基因中ATF3高表达的肝内胆管癌患者生存率较高，见图2。

图2 不同关键基因表达的肝内胆管癌预后生存曲线

3 讨论

目前，美国国家综合癌症网络推荐吉西他滨、顺铂、氟尿嘧啶作为胆管癌的临床化疗方案，然而吉西他滨的耐药问题，是导致治疗失败的关键因素。吉西他滨进入人体代谢为吉西他滨二磷酸盐和吉西他滨三磷酸盐［8］。其中吉西他滨二磷酸盐通过抑制核糖核酸还原酶，减少DNA合成原料三磷酸脱氧核苷产生，从而抑制DNA的合成；吉西他滨三磷酸盐则与脱氧三磷酸胞苷竞争结合到DNA链上，同时吉西他滨二磷酸盐可以发挥协同作用，促进吉西他滨三磷酸盐与DNA的结合，抑制DNA进一步合成，最终导致细胞凋亡［9］。

我们通过生物信息学方法发现吉西他滨耐药株相较于敏感株，有589个差异基因，其中上调基因314个、下调基因275个。富集分析发现上调基因主要参与DNA复制、修复，细胞有丝分裂等过程。下调基因主要参与血管生成、低氧应答、线粒体自噬、自噬体组装等过程，目前的研究表明抑制自噬可以导致肿瘤对多种化学药物的敏感性，降低化疗对于肿瘤的作用［10］。提示吉西他滨耐药株可能通过上调DNA修复与复制相关基因，下调自噬相关基因，从而降低肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性。

在差异基因中进一步筛选出关键基因MCM2、MCM6、CDC45和ATF3，发现其在肝内胆管癌的吉西他滨耐药和患者生存情况中发挥重要作用。MCM2和MCM6是MCM家族成员，MCM2-7可以相互作用形成功能性DNA解旋酶，触发DNA合成的初始步骤［11］，促进细胞的复制。无限复制是肿瘤细胞的特征之一，MCM蛋白被认为与癌症发展密切相关，可以作为多种肿瘤的标志物，同时也被认为与肿瘤的预后相关［12］。目前在多种肿瘤组织和癌症细胞中检测到MCM家族蛋白高表达［13-14］。MCM2-7复合物被激活时，CDC45会被招募到MCM2-7复合物的尾部，激活其解旋酶活性，从而促进DNA的复制。过量的MCM家族蛋白表达被认为可以对DNA复制的稳定性起到保护作用［15］。而CDC45的突变会显著降低MCM复合物的解旋酶活性［16］。

化疗作为临床治疗肿瘤的主要手段，主要通过诱导DNA损伤及复制来抑制肿瘤细胞的增殖。MCM2、MCM6和CDC45可 能 是 通 过 形 成CDC45-MCM-GINS（CMG）复合物从而促进DNA的复制与修复，导致肿瘤细胞对吉西他滨耐药。在临床研究中也发现MCM家族蛋白高表达会导致肿瘤对多种化疗药物产生耐药性，抑制MCM2可以降低肿瘤细胞对于顺铂的耐药性［17］。而通过抑制MCM4和MCM7引起MCM复合物抑制也可以增强胰腺导管癌对5-氟尿嘧啶和吉西他滨的敏感性［18］。

核糖核苷酸还原酶（RR）在维持脱氧核糖核苷酸库中发挥重要作用。下调RR减少吉西他滨与脱氧胞苷之间的竞争，从而增强了吉西他滨的作用。因此可通过抑制RR亚基M1（RRM1）来增强吉西他滨的作用，该基因的上调会导致吉西他滨耐药［19］。这与我们发现吉西他滨耐药株中RRM1明显上升的结果相一致。研究发现MCM2-7复合物可以调控RRM1的表达，这可能也是MCM2和MCM6引起吉西他滨耐药的原因。

临床研究表明，二甲双胍可以选择性抑制MCM2从而增强肿瘤细胞化疗的敏感性［20］；此外上皮间质转化（EMT）被认为是吉西他滨耐药的关键原因之一，有研究表明MCM2-7复合物的形成可以显著促进EMT的发生［21］。二甲双胍和吉西他滨联合使用则可以抑制EMT的发生，增强肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性［22］。中药组分大黄素可以通过抑制肿瘤细胞EMT同时增强肿瘤对于吉西他滨的敏感性，增强吉西他滨的效果［23-24］，这可能是通过抑制MCM复合物诱导的RRM1表达引起的。

下调基因ATF3是ATF/环AMP反应元件结合（ATF/CREB）转录因子家族的成员，可以被缺氧、DNA损伤等多种应激因素激活，参与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等过程。近年发现ATF3在多种肿瘤中可以起到影响化疗药物敏感性的作用。HASIM等［25］发现使用ATF3诱导剂可以显著增强阿霉素对于乳腺癌细胞的毒性作用、提高乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。此外吉西他滨可以通过促进活性氧产生，引起肿瘤细胞死亡。为了减轻ROS诱导的氧化应激，肿瘤细胞上调转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2），催化谷胱甘肽（GSH）生成，引发对吉西他滨的耐药［26］。ATF3可以通过调节Hippo-TAZ pathway通路，抑制Nrf2-Keap1的保护作用，从而促进肿瘤对化疗药物的敏感性［27-28］。

综上所述，本研究通过生物信息学技术分析肝内胆管癌耐药株差异基因，发现其主要通过上调DNA复制及修复相关基因，抑制自噬相关基因，引起肝内胆管癌对吉西他滨耐药。进一步筛选出其中关键基因，发现上调基因中的关键基因为MCM3、CDC45、MCM2、CDC6、MCM4、FEN1、MCM6、PCNA、EXO1和WDHD1。下调基因中的关键基因为VEG‑FA、FOS、EGR1、DUSP1、ITGB1、ATF3、GABARA‑PL1、FOSB、MAP1LC3A、ULK1。我们发现MCM2、MCM6、CDC45在肿瘤组织中高表达，其中MCM2、MCM6、CDC45高表达肝内胆管癌患者生存率低，而ATF3高表达的患者生存率高。提示MCM2、MCM6、CDC45可能在肝内胆管癌的发生及发展中也发挥重要作用。但基于生物信息学自身局限性，结论仍有待于进一步的实验验证。