绿豆淀粉纯化工艺及性质的研究

刘 颖，袁 翔，黄惠庭，王文婷，唐苗苗，邢蕾，李海明

（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州234000）

0 引言

绿豆在我国广泛种植，其营养成分丰富，籽粒中淀粉含量可达50%，蛋白质含量为19.7%~32.1%[1]。淀粉是一种储存多糖，其在植物生长时期以淀粉粒形式储存于细胞中，在种子、块茎和块根等器官中含量十分充足。植物淀粉在食品生产中发挥着很大作用，其对动物体也有极其重要的生理功能，如供应能量、形成机体组织、节约蛋白等。绿豆淀粉所提供的能量值很低，这在消费者追求健康均衡生活的新时代显得尤为重要。另外，绿豆淀粉也具备改善肠道菌群环境、减少大量有害物质吸收的功能。绿豆淀粉被普遍应用于食品加工中，也与其独特的透明度、溶解度、膨润力和冻融稳定性等性质有关，这些特性对食品成品的最终质量有极其重要的影响。

如今，国内外学者虽然对绿豆淀粉提取和性质广泛关注，但对其研究通常报道得不够具体。我国的淀粉工业发展存在淀粉产率偏低、品种单一等问题[2]。绿豆中淀粉含量一般在50%以上，但其提取效率有限，不利于充分利用绿豆的优良品质，一定程度上对绿豆原料造成很大浪费。试验利用水磨法提取绿豆淀粉后采用酶法除去蛋白以纯化淀粉，通过单因素试验及正交试验获得最佳纯化工艺，既能保证绿豆淀粉提取率及纯度，又能使生产能耗降低、纯化时间缩短，研究纯化后绿豆淀粉的理化性质，以期为提高其综合利用价值提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

1.1.1 主要原料

绿豆，市售。

1.1.2 主要试剂

氢氧化钠、氯化钠、无水乙醇，西陇化工股份有限公司提供；盐酸、乙醚，上海苏懿化学试剂有限公司提供；牛血清白蛋白，国药集团化学试剂有限公司提供；碱性蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司提供。

1.2 主要仪器

全自动豆浆机，九阳股份有限公司产品；SHZD（Ⅲ）型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司产品；电子天平，上海越平科学仪器有限公司产品；H1805型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；UV-5100H型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；SU1510型扫描电子显微镜，株式会社日立高新技术那柯事业所产品；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品。

1.3 绿豆淀粉纯化工艺

1.3.1 水磨法提取绿豆淀粉工艺

参照Liu W，王立东等人[3-4]对绿豆淀粉的提取方法，并加以改动：按料液比1∶4（g∶mL）将50 g绿豆浸泡于水中，于40℃下浸泡时间14 h，加900 mL蒸馏水进行第1次磨浆，豆浆用纱布过滤后收集残渣进行第2次磨浆，再次过滤、离心，取底部淀粉用蒸馏水洗涤，得淀粉半成品。用无水乙醇对所得淀粉半成品进行3次抽滤洗涤，再用无水乙醇和乙醚按1∶1比例混合抽滤1次，最后用乙醚抽滤1次，将除脂肪后的淀粉半成品置于45℃下烘干过夜。粉碎即为绿豆粗淀粉。

1.3.2 淀粉中蛋白质含量测定

（1）标准曲线的绘制。

添加试剂见表1。

表1 添加试剂

采用紫外分光光度法测定绿豆淀粉中蛋白质的含量。按表1依次加入质量浓度为1.00 mg/mL牛血清白蛋白质标准溶液和0.9%氯化钠溶液，于波长280 nm处分别测出吸光度，绘制标准曲线[5]。

（2）待测样品的测定。取待测淀粉溶解于0.9%氯化钠溶液中，定容至100 mL，按上述方法测定在波长280 nm处的吸光度，对照标准曲线求出淀粉中蛋白含量。

1.3.3 酶法除蛋白纯化绿豆淀粉工艺

（1）工艺流程。提取的粗淀粉采用碱性蛋白酶进行除蛋白质纯化操作，参考陈振家，胡爱军等人[6-7]对豆类淀粉酶法提取纯化工艺的研究方法并稍加改动。分别称取同一条件下制得的粗淀粉2.5 g于4支试管中，以1∶8（g∶mL）的料液比加入蒸馏水，并将其pH值调至所需的碱性环境，加入一定量的碱性蛋白酶，在一定温度的水浴锅中酶解一定时间后，以转速3 400 r/min离心10 min，除上清液，取下层沉淀，用蒸馏水洗涤、离心，取沉淀，反复3次，置于45℃电热鼓风干燥箱中烘干过夜，得到纯化绿豆淀粉。

（2）单因素试验。设计单因素试验，研究当酶解温度55℃，酶用量600 U/g，酶解液pH值9时，不同酶解时间（2，3，4，5，6 h）对绿豆淀粉中蛋白质残余量的影响；当酶解时间4 h，酶用量600 U/g，酶解液pH值9时，不同酶解温度（35，45，55，65，75℃）对绿豆淀粉中蛋白残余量的影响；当酶解时间4 h，酶解温度55℃，酶解液pH值9时，不同酶用量（400，500，600，700，800 U/g）对绿豆淀粉中蛋白质残余量的影响；当酶解时间4 h，酶解温度55℃，酶用量600 U/g时，不同酶解液pH值（7，8，9，10，11）对绿豆淀粉中蛋白质残余量的影响[7]。

（3）正交试验。按表2设计四因素三水平L9（34）的正交试验，确定纯化工艺最佳参数。

酶法除蛋白质纯化淀粉正交试验因素与水平设计见表2。

表2 酶法除蛋白质纯化淀粉正交试验因素与水平设计

1.3.4 绿豆淀粉理化性质的研究

（1）淀粉颗粒形貌观察。扫描电子显微镜观察淀粉颗粒形貌，参照裴亚琼等人[8]的方法进行测定。

（2）淀粉糊透明度测定。参考侯蕾等人[9]的方法并加以改动进行测定。

（3）淀粉糊溶解度和膨润力测定。参考郭神旺等人[10]对主要杂豆淀粉理化性质的分析方法并加以改动进行测定。

（4）淀粉糊冻融稳定性测定。参考王鹏等人[11]对豆类淀粉的研究方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 酶法除蛋白纯化绿豆淀粉试验结果

2.1.1 单因素试验结果

（1）酶解时间对淀粉中蛋白残余量的影响。

不同酶解时间对淀粉中蛋白残余量的影响见图1。

图1 不同酶解时间对淀粉中蛋白质残余量的影响

由图1可知，随着酶解时间的增加，蛋白残余量逐渐递减，酶解时间超过4 h后，蛋白残余量变化不大，基本趋于稳定。这可能是因为开始时溶液中酶的浓度较高，所以在2~4 h绿豆淀粉中的蛋白质残余量不断减少，随着反应的进行，溶液中酶浓度逐渐变小，酶的活性也逐渐降低，导致淀粉与蛋白质分离速度减慢甚至不再分离，且淀粉中蛋白近乎除尽，因此蛋白质残余量基本不变[12]。因此，选择4 h为最适酶解时间。

（2）酶解温度对淀粉中蛋白质残余量的影响。

不同酶解温度对淀粉中蛋白质残余量的影响见图2。

图2 不同酶解温度对淀粉中蛋白质残余量的影响

由图2可知，当酶解温度上升到55℃时，淀粉中蛋白质残余量最少，为5.4 mg/g；当温度超过55℃后，蛋白质残余量呈上升趋势，这可能是因为温度过高会导致蛋白质的结构改变，从而降低其溶解度，不利于蛋白质的溶出而随淀粉下沉[6]；并且高温也会引起碱性蛋白酶变性失活，水解速度降低[13]。因此，选择55℃为最适酶解温度。

（3）酶用量对淀粉中蛋白质残余量的影响。

不同酶用量对淀粉中蛋白质残余量的影响见图3。

由图3可知，随着酶用量的不断增加，蛋白质残余量不断减少，但当酶用量达到600 U/g之后，蛋白质残余量较小幅度上升。这可能是由于刚开始酶用量低于底物浓度，酶促反应速度随着酶用量的增加而加快，当酶用量继续增加直到过量时，使蛋白质过度水解从而暴露更多疏水性基团，形成不溶性聚集体，降低了蛋白质的溶解度，从而导致淀粉中蛋白质残余量上升[6]。因此，选择600 U/g为最合适的酶用量。

图3 不同酶用量对淀粉中蛋白质残余量的影响

（4）酶解液pH值对淀粉中蛋白质残余量的影响。

不同酶解液pH值对淀粉中蛋白质残余量的影响见图4。

图4 不同酶解液pH值对淀粉中蛋白质残余量的影响

由图4可知，当酶解液pH值逐渐增大时，淀粉蛋白质残余量逐渐减少，这是因为随着酶解液pH值的增大，碱性蛋白酶的活性也逐渐提高[6]。当酶解液pH值为9时，蛋白质残余量最少，为5.3 mg/g；但当酶解液pH值继续增大时，淀粉蛋白质残余量逐渐增加，这是因为高pH值的碱性环境可能会导致部分淀粉糊化，增大溶液的黏度[14]，使蛋白质不易从淀粉中溶出，同时过高的pH值环境也会降低碱性蛋白酶的酶活。因此，选择最适酶解液pH值为9。

2.1.2 正交优化试验结果

酶法除蛋白质纯化绿豆淀粉正交试验结果分析见表3。

表3 酶法除蛋白质纯化绿豆淀粉正交试验结果分析

由表3可知，绿豆淀粉蛋白质残余量的极差R值在0.16~0.60，每个因素对蛋白质残余量的影响作用顺序为酶解时间>酶解温度>酶用量>酶解液pH值，绿豆淀粉纯化的最佳工艺条件组合为A3B3C1D1，即酶解时间4.5 h，酶解温度60℃，酶用量550 U/g，酶解液pH值9。

2.1.3 绿豆淀粉纯化的验证性试验

参照正交优化试验得到的最佳因素组合进行验证，重复3次并取平均值得到绿豆淀粉蛋白质残余量为3.9 mg/g。

2.2 绿豆淀粉理化性质研究结果

2.2.1 淀粉颗粒扫描电镜观察

分别对除蛋白质纯化后的淀粉颗粒及未纯化的淀粉颗粒进行电镜扫描。

纯化及未纯化绿豆淀粉颗粒形态图见图5。

图5 纯化及未纯化绿豆淀粉颗粒形态图

由图5可知，体积较小的绿豆淀粉颗粒一般为圆形，而体积稍大的绿豆淀粉颗粒为椭圆形。图a、图b为用碱性蛋白酶纯化除蛋白质后的绿豆淀粉颗粒，表面虽有凹痕但较为光滑；图c、图d为未用碱性蛋白酶纯化的淀粉颗粒，颗粒表面有少许附着物，不光滑，其可能是还未除去的淀粉残余蛋白质。

2.2.2 淀粉糊透明度

绿豆淀粉糊透明度随时间的变化见图6。

图6 绿豆淀粉糊透明度随时间的变化

淀粉的透明度反映了淀粉与水的结合能力，一般用透光率来表示透明度的强度，淀粉中的直支比是影响淀粉糊透明度的重要因素[15]。由图6可知，绿豆淀粉糊的透光率随着放置时间的增加而逐步下降，即透明度逐渐降低。在粉丝生产中，透明度与其口感、外观的光泽度有直接关系。

2.2.3 淀粉糊溶解度和膨润力

绿豆淀粉糊溶解度随温度的变化见图7，绿豆淀粉糊膨润力随温度的变化见图8。

图7 绿豆淀粉糊溶解度随温度的变化

图8 绿豆淀粉糊膨润力随温度的变化

淀粉分子与水分子之间的相互作用可依据不同温度下的溶胀吸水和直链淀粉的析出表现出来[16]。由图7可知，淀粉糊的溶解度与温度呈正相关，当温度为100℃时，其溶解度达到最大，为31.11%；由图8可知，绿豆淀粉糊的膨润力随着温度的升高而逐步增大，最大为23.22%。

2.2.4 淀粉糊冻融稳定性

冻融稳定性随淀粉糊质量分数的变化见图9。

图9 冻融稳定性随淀粉糊质量分数的变化

冻融稳定性为淀粉糊耐受冷冻、融解等剧烈物理变化的能力，一般用析水率来表示冻融稳定性，析水率越大，冻融稳定性就越差。从图9可知，当淀粉糊质量分数为2%时，其析水率达到54.37%，极不稳定，随着绿豆淀粉糊的质量分数不断增加，析水率逐步下降且趋于平缓，冻融稳定性越来越好。

3 结论

采用水磨法提取绿豆淀粉，并使用酶法除蛋白以纯化淀粉，通过单因素试验及正交试验获得最佳纯化工艺条件为酶解时间4.5 h，酶解温度60℃，酶用量550 U/g，酶解液pH值9，在此工艺条件下，所制得的绿豆淀粉中蛋白质残余量最少，为3.9 mg/g，淀粉纯化效果最佳。绿豆淀粉颗粒表面较为光滑，呈圆形或椭圆形。绿豆淀粉糊的透明度与时间呈负相关，溶解度和膨润力与温度呈正相关，冻融稳定性随淀粉糊质量分数的增加而越来越高。研究为更高效地提取纯化绿豆淀粉及提高其综合利用价值提供了一定的理论参考。