双酶法提取大蒜水溶性膳食纤维及其抗氧化活性分析

张 云，苗敬芝，2，董玉玮，2，李 勇，2，邓锦慧，罗 姣

（1.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州221018；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州221018）

0 引言

大蒜为百合科葱属植物蒜的鳞茎，是一种药食同源的蔬菜[1]。大蒜含有多种生物活性物质，主要有氨基酸、膳食纤维、大蒜素、黄酮类、维生素、微量元素等，具有抗菌消炎、抗氧化防衰老、清除体内自由基、增强机体免疫力等生理功能[2-4]。膳食纤维根据其溶解性不同，分为水溶性膳食纤维（SDF）和水不溶性膳食纤维（IDF）两大类。研究表明，水溶性膳食纤维对人体有多种生理功效，如增强肠道益生菌群、防癌抗癌、降血糖、降血脂、预防糖尿病等[5-7]。

试验采用双酶法提取大蒜水溶性膳食纤维，利用酶的专一性、高效性、反应条件温和等优势，缩短提取时间、提高提取效率[8]，通过单因素试验和正交试验优化大蒜水溶性膳食纤维的提取工艺条件，并对其抗氧化活性进行研究，为大蒜的综合开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜，购于徐州华联超市；纤维素酶（50 000 U/g）、木瓜蛋白酶（50 000 U/g），江苏锐阳生物科技有限公司提供；抗坏血酸、柠檬酸、柠檬酸钠、DPPH、邻苯三酚、95%乙醇等，均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

DHG-9075A型电热鼓风干燥箱，上海慧泰仪器制造有限公司产品；HH-4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；723G型可见分光光度计，上海分析仪器有限公司产品；TDL-6型低速大容量离心机，金坛晨阳电子仪器厂产品；SENCO型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 大蒜SDF提取工艺流程

大蒜→去皮、清洗→切片、护色（0.5%抗坏血酸）→烘干、粉碎，过筛→称取样品→按一定料液比加柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液→加纤维素酶和木瓜蛋白酶→酶解→灭酶→过滤，取滤液，加入4倍体积95%乙醇醇沉→过滤、滤渣干燥，称质量→成品。

1.3.2 单因素试验

设置纤维素酶加酶量、木瓜蛋白酶加酶量、酶解时间、酶解温度4个因素进行单因素试验。

大蒜SDF提取单因素试验见表1。

表1 大蒜SDF提取单因素试验

1.3.3 正交试验设计

基于单因素试验结果，考查纤维素酶加酶量、木瓜蛋白酶加酶量、酶解时间、酶解温度对大蒜SDF得率的影响。

正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计

1.3.4 大蒜SDF抗氧化活性分析

（1）对O2-自由基清除率的测定[9]。分别取不同质量浓度大蒜SDF各2.00 mL，依次加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH值8.2）4.0 mL置于试管中，于25℃下水浴20 min，加2.5 mmol/L邻苯三酚溶液2 mL，充分混匀，于25℃下反应5 min，加8%的盐酸溶液2 mL终止反应。以蒸馏水作空白试验，于波长325 nm处测定吸光度。计算不同质量浓度的大蒜SDF对O2-自由基的清除率。

式中：A1——样品的吸光度；

A0——空白品的吸光度。

（2）对DPPH自由基清除率的测定[10]。分别取不同质量浓度大蒜SDF各2.00 mL，依次加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，于25℃下反应25 min，于波长517 nm处测定吸光度。以蒸馏水作空白试验，以相同质量浓度的维C溶液作对比，计算不同质量浓度大蒜SDF对DPPH的清除率。

式中：A1——样品的吸光度；

A0——空白品的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验条件选择

2.1.1 纤维素酶加酶量纤维素酶加酶量对大蒜SDF得率的影响见图1。由图1可知，随着纤维素酶加酶量的增加，大蒜SDF得率先增后降，1.6%时得率最高为29.5%。在一定质量浓度范围内，随着酶质量浓度增加，酶与底物接触几率增加，酶与底物质量浓度最合适时，有利于水溶性膳食纤维的释放，酶质量浓度过高，底物质量浓度不足，酶解效率降低[11]。因此，纤维素酶最适加酶量为1.6%。

图1 纤维素酶加酶量对大蒜SDF得率的影响

2.1.2 木瓜蛋白酶加酶量

由图2可知，随着木瓜蛋白酶加酶量的增加，大蒜SDF得率上升，2.2%时得率最高为28.8%，之后呈下降趋势。因此，木瓜蛋白酶最适加酶量为2.2%。

图2 木瓜蛋白酶加酶量对大蒜SDF得率的影响

2.1.3 酶解时间

酶解时间对大蒜SDF得率的影响见图3。

由图3可知，随着酶解时间增加，大蒜SDF得率上升，180 min时达到最高为30.50%，之后呈下降趋势，可能随着时间延长，大蒜SDF部分降解。因此，最适酶解时间为180 min。

图3 酶解时间对大蒜SDF得率的影响

2.1.4 酶解温度

酶解温度对大蒜SDF得率的影响见图4。

图4 酶解温度对大蒜SDF得率的影响

由图4可知，随着酶解温度升高大蒜SDF得率上升，温度50℃时达到最高为30.60%，之后下降。温度升高，分子运动加快，使溶质快速溶出，大蒜SDF得率提高，温度过高，酶分子的空间结构发生改变，酶活性降低，影响酶促反应的进行，大蒜SDF得率下降[12]。因此，最适酶解温度为50℃。

2.2 正交试验优化大蒜SDF提取工艺条件

大蒜SDF提取正交试验结果见表3。

表3 大蒜SDF提取正交试验结果

由表3可知，各单因素对大蒜SDF得率的影响大小顺序为B>A>D>C，即木瓜蛋白酶加酶量>纤维素酶加酶量>酶解温度>酶解时间。大蒜SDF最佳提取工艺条件是A3B2C2D3，即纤维素酶加酶量2.2%，木瓜蛋白酶加酶量2.2%，酶解时间180 min，酶解温度55℃。在此条件下进行3次验证试验，取其平均值大蒜SDF得率为32.06%。

2.3 大蒜SDF抗氧化活性分析结果

2.3.1 大蒜SDF对O2-自由基的清除效果

大蒜SDF对O2-自由基的清除效果见图5。

图5 大蒜SDF对O2-自由基的清除效果

由图5可知，随着大蒜SDF质量浓度的增加对O2-自由基的清除率增大，当大蒜SDF质量浓度0.7 mg/mL时，清除率80.01%，清除效果明显，之后清除率变化缓慢。

2.3.2 大蒜SDF对DPPH自由基的清除效果

大蒜SDF对DPPH自由基的清除效果见图6。

图6 大蒜SDF对DPPH自由基的清除效果

由图6可知，随着大蒜SDF质量浓度的增加对DPPH自由基的清除率增大，当大蒜质量浓度0.7 mg/mL时，清除率80.15%，之后清除率变化缓慢，说明大蒜SDF对DPPH自由基具有较强的清除能力。

3 结论

（1）通过单因素试验和正交试验优化大蒜SDF提取的工艺条件，各因素对大蒜SDF得率的影响大小顺序为B>A>D>C，即木瓜蛋白酶加酶量>纤维素酶加酶量>酶解温度>酶解时间；大蒜SDF最佳提取工艺条件是A3B2C2D3，即纤维素酶加酶量2.2%，木瓜蛋白酶加酶量2.2%，酶解时间180 min，酶解温度55℃，大蒜SDF得率为32.06%。

（2）大蒜SDF对O2-自由基和DPPH自由基均表现出较强的清除能力，且随着质量浓度的增加清除率增大，呈明显的量效关系。表明它是一种优质的食物纤维，可作为一种天然绿色的食品添加剂，添加到乳制品、焙烤制品、饮料等产品中，具有良好的应用前景。