KRAS、BRAF基因突变的结直肠癌患者临床病理特征分析

刘威，王菲，杜洪，缪娜波，李旺林,，曹杰,

(1.广州医科大学附属广州市第一人民医院，广州消化疾病中心，结直肠肛门外科,广东 广州 510180; 2.广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院，华南理工大学消化疾病研究所,广东 广州 510180; 3.广州市第一人民医院，华南理工大学附属第二医院病理科，广东 广州 510180)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤，最新研究表明，CRC在世界范围内发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第3位和第2位[1]。在中国，CRC的发病率和死亡率也呈逐年上升趋势[2-4]，预测在2025年，中国CRC发病人数和死亡人数将分别达到64.23万例和22.11万例[5]。因其发病隐匿，多数确诊都属于中晚期，而晚期CRC患者5年生存率只有14%[6]。除了手术治疗、化疗、放疗等常规治疗外，针对表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)的分子靶向药物西妥昔单抗、帕尼单抗等在晚期CRC患者中也得到了越来越广泛的应用[7-13]。研究表明抗EGFR靶向治疗效果与KRAS和BRAF基因突变密切相关，KRAS和BRAF基因野生型患者在抗EGFR靶向治疗中获益更多[9-20]。

目前，相关研究主要集中在KRAS和BRAF基因的突变频率及其预后价值上，但对于这些基因突变与患者临床病理特征的关系仍缺乏了解，本研究回顾性分析了2017年7月至2020年12月我院收治的724例CRC患者的KRAS基因和BRAF基因突变情况，以及KRAS基因和BRAF基因突变与临床病理特征的相关性，为CRC的个体化分子靶向治疗提供理论指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集广州市第一人民医院2017年7月至2020年12月期间收治的724例CRC患者的临床病理资料，年龄19～94岁，平均年龄(64.55±12.39)岁，所有患者均进行KRAS及BRAF基因突变的检测。本研究经医院伦理委员会批准，并取得患者本人或其家属的知情同意。

1.2 纳入标准和排除标准

纳入标准：(1)病理确诊为CRC；(2)行外科手术切除；(3)接受KRAS及BRAF基因突变检测；(4)临床病理资料完整。排除标准：合并其他类型恶性肿瘤。

1.3 实验方法

1.3.1组织DNA的提取 选取1～3张5 μm厚的石蜡包埋的CRC组织切片，按照FFPE样品DNA分离试剂盒说明书(离心柱型)(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)提取基因组DNA。

1.3.2基因突变检测 按照人类KRAS基因突变检测试剂盒、人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒(厦门艾德生物医药科技股份有限公司)，运用突变阻滞扩增系统PCR检测KRAS基因第2、3、4号外显子突变及BRAF基因第15号外显子第600位密码子突变。

1.3.3免疫组化 本研究通过免疫组化检测了MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、Ki-67、P53、CD34、D2-40、S-100在蛋白水平的表达情况，使用的抗体信息如下：MLH1兔单抗、PMS2兔单抗、MSH2兔单抗、MSH6兔单抗、Ki-67兔单抗、CD34兔单抗、D2-40兔单抗、S-100兔单抗(广州安必平医药科技股份有限公司)、P53鼠单抗(上海罗氏制药有限公司)。CD34、D2-40用于了解脉管浸润情况，S-100用于了解神经浸润情况。

其中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6为错配修复(mismatch repair，MMR)蛋白，观察染色强度，根据有无着色分为阳性表达和阴性表达，至少1种错配修复蛋白表达阴性为错配修复功能缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)，4种错配修复蛋白表达阳性为错配修复功能完整(proficient mismatch repair，pMMR)。计数着色细胞所占百分比：每张切片先低倍镜观察全片，然后随机选取10个视野，在高倍镜下计数200个细胞中阳性细胞所占的比例，Ki-67按照阳性细胞表达比例分为4组：0(0%～5%)，1(6%～25%)，2(26%～50%)，3(>50%)。P53、脉管、神经浸润观察染色强度，根据有无着色分为阳性表达和阴性表达。

1.4 临床病理特征

收集患者的性别、年龄、肿瘤原发部位、TNM分期、大体类型、分化程度、组织学分型等临床病理特征，根据KRAS和BRAF基因突变情况，将CRC患者分为野生型(wild type，WT)、KRAS突变型(KRAS mutation，KRAS MT)和BRAF突变型(BRAF mutation，BRAF MT)3组，其中不包含KRAS和BRAF双突变类型。3组患者的临床病理特征进行两两比较。

1.5 统计学分析

应用SPSS 25.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示；计数资料以绝对数和百分比[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。并非全部患者进行免疫组化指标检测，未进行免疫组化检测的患者计入未知病例，不纳入统计学分析。双侧P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 724例CRC患者整体特征

CRC患者整体临床病理特征及免疫组化信息见表1。

表1 CRC患者整体特征(724例)

2.2 KRAS和BRAF基因突变类型情况

724例CRC患者中，KRAS基因总突变率为30.4%(220/724)，第2号外显子突变率最高，为27.6%(200/724)，且差异具有统计学意义(P<0.05)；BRAF基因第15号外显子V600E位点突变率为4.0%(29/724)。2种基因外显子突变情况见表2。

表2 KRAS和BRAF基因不同外显子突变比例

2.3 KRAS和BRAF基因突变类型与临床病理特征的关系

本研究回顾性分析了不同基因突变类型CRC的临床病理特征，将WT组、KRAS MT组、BRAF MT组两两进行比较。与WT组相比，KRAS突变的CRC多发生于男性，浸润型比例更高(P<0.05)；与WT组相比，BRAF突变的CRC多发生于女性、右半结肠，dMMR、浸润型、低分化或黏液腺癌比例更高(P<0.05)。与KRAS突变的CRC相比，BRAF突变的CRC多发生于右半结肠，dMMR、低分化或黏液腺癌比例更高(P<0.05)(表3)。

表3 野生型与KRAS、BRAF基因突变的CRC临床病理特征的对比

3 讨 论

CRC的发生发展受多因素、多基因和多个信号通路的影响，其中EGFR信号通路与CRC的发生发展密切相关。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，二聚体化后通过激活RAS蛋白，从而激活下游的RAS/RAF/MAPK信号通路，进而实现信号通路的传导及诱导肿瘤细胞的增殖、分化等多种生物学功能[21]。RAS基因最早于1982年在鼠肉瘤病毒中被发现，因此被命名为RAS(rat sarcoma)基因[22]，KRAS基因定位于人类染色体12p，与HRAS基因、NRAS基因同属于RAS基因家族。BRAF基因定位于人类染色体7q，编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与ARAF、CRAF同属于RAF基因家族。KRAS基因和BRAF基因作为EGFR信号通路下游关键分子，与抗EGFR治疗耐药性密切相关。CRC患者治疗前行常规KRAS和BRAF基因突变检测，这对于EGFR靶向药物的使用和患者预后非常重要[7-15]。

研究表明，与野生型CRC相比，KRAS和BRAF突变的CRC有特异性的临床、病理和分子特征，突变基因与肿瘤恶性程度有关[18,26]。KRAS基因和BRAF基因虽同属一条信号通路，但KRAS突变和BRAF突变同时发生的比例较低，且两种突变类型的CRC常表现出不同的临床病理特征[23,27]。例如，KRAS突变的CRC具有更强的侵袭性，多发生于左半结肠，容易发生肺转移，预后较差，与MSS/pMMR状态相关[21,27-29]。而BRAF突变的CRC多发生于老年女性、右半结肠，预后也很差，且更容易发生肝、腹膜及远处淋巴结转移[16,22,25]；在病理特征方面表现为分化差、黏液腺癌成分增多和高侵袭性，与MSI-H/dMMR状态相关。BRAF突变是锯齿状通路的驱动因素，锯齿状息肉也被认为是CRC的前驱病变，而锯齿状息肉最常见于MSI-H/dMMR的CRC，这很好地解释了BRAF突变和MSI-H/dMMR的关系[26,27]。

本研究通过对比发现，BRAF突变的CRC多发生于右半结肠，dMMR、低分化或黏液腺癌比例更高，KRAS突变的CRC多发生于左半结肠，pMMR、高、中分化腺癌比例更高，提示与野生型和KRAS基因突变的CRC相比，BRAF突变的CRC可能预后更差，这些都与相关报道一致[23,24,27]。

总之，本研究通过在较大样本的CRC患者中分析KRAS和BRAF基因突变类型状态，对比KRAS和BRAF两种突变类型的CRC临床病理特征，发现与KRAS突变的CRC相比，BRAF突变的CRC多发生于右半结肠，dMMR、低分化或黏液腺癌比例更高，恶性程度更高。可能提示两种基因在CRC发生、发展过程中存在的差异性特征，临床需要对这两种基因进行常规检测，才能更好地指导CRC的个体化靶向治疗。但是KRAS和BRAF突变在CRC发生、发展过程中的作用机制以及抗EGFR的治疗效果和预后情况还有待进一步研究。