UPF1通过mTOR/AKT信号通路调控膀胱癌的发生机制

林海，林芮峰，邹自灏，刘平，钟剑峰，高兴成*

(1.广州医科大学附属第一医院微创外科中心泌尿外科，广东省泌尿外科重点实验室 ；2.广州医科大学附属第三医院泌尿外科，广东 广州 510150)

膀胱癌是全球排名第十的常见癌症，是男性的第六常见癌症和第九癌症死亡原因，根据2018年的统计数据显示全球估计有549 000例新发病例和200 000例死亡病例，男性的发病率和死亡率分别为9.6/10万和3.2/10万，约为女性的4倍[1]。在膀胱癌新发病例中，约80%为非肌层浸润膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer，NMIBC)，但其复发率高达60%～70%[2]。尽管近年来膀胱癌的外科手术以及药物治疗手段不断提高，但因膀胱癌早期诊断技术缺乏特异性、灵敏性，且膀胱肿瘤手术治疗术后具有复发率高、恶性转化程度强等特点，三十年来膀胱癌的5年存活率没有明显改善[2]。现已有越来越多的证据表明早期干预可以改善膀胱癌总体生存率，可以避免多达31%-47%的膀胱癌患者死亡[3]，这强调了及早发现和及早治疗的重要性。因此，研究膀胱癌的发生机制，寻找新的治疗靶标具有重要意义。

无义介导的mRNA 降解途径(nonsense-mediated mRNA degradation pathway，NMD)具有降解异常mRNA的能力，可以防止异常蛋白质的产生，是人体内mRNA质量的监控系统。上游移码突变体(up-frameshift mutant 1，UPF1)是一种RNA结合蛋白，也是NMD中的关键蛋白[4-5]。UPF1与UPF2和UPF3构成核心NMD因子，通过复杂的步骤，降解异常mRNA，阻止其翻译[6-9]。UPF1 被认为是NMD 最重要的因子，NMD的激活必须要UPF1与靶mRNA 上的蛋白质相互作用，才具有发挥其降解作用功能[5]。研究表明UPF1不仅参与NMD降解异常mRNA，而且调节正常的基因表达参与细胞增殖和分化[10]。近年研究报道UPF1在多种肿瘤中起着各种作用[11-19]，越来越多学者将目光投向UPF1与肿瘤之间的关系，而UPF1在膀胱癌之中的作用意义仍无人研究。

在本研究中，通过相关肿瘤生信数据库发现膀胱癌组织中UPF1的表达与癌旁正常组织相比明显增高。膀胱癌组织中UPF1的表达量促使我们研究NMD是否参与膀胱癌的发生发展。进一步的实验表明，过表达UPF1可以促进膀胱癌细胞的增殖、迁徙、侵袭能力。这些结果表明，UPF1参与调控膀胱癌的发生发展。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人膀胱癌细胞5637和T24细胞株购于ATCC。将细胞培养于1640培养基(Gibco)中，并补充10%胎牛血清(Gibco),1%双抗(青霉素和链霉素)，在37 ℃，体积分数含5%CO2的潮湿空气中培养。

1.2 生信分析UPF1的表达水平并使用标本验证

使用GEPIA数据库和ONCOMINE数据库分析膀胱癌组织和正常膀胱组织中的差异基因表达水平，检索UPF1在膀胱癌组织和正常膀胱组织中的相对表达情况，下载相关数据图表。使用实时荧光定量PCR法检测膀胱癌组织以及膀胱癌细胞系中UPF1的mRNA相对表达水平，GAPDH 作为内参。

1.3 实时荧光定量PCR

用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA。根据产品说明书，使用PrimeScript TM reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA)将总RNA反转录为cDNA。根据SYBR Green预混液(Thermo)的方案检测mRNA表达水平，并在ABI Prism StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Bi-osystems)上进行实时荧光定量PCR，每个样品重复3个复孔。通过2-ΔΔct方法计算每个转录物的表达。所使用的引物序列为：UPF1上游引物5’-CTGCAACGGACGTGGAAATAC-3’,下游引物5’-ACAGCCGCAGTTGTAGCAC-3’；GAPDH游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.4 过表达质粒构建、提取和转染

UPF1过表达质粒由生工生物工程股份有限公司设计并合成，取10 uL菌液、20 uL AMP加入20 mL LB培养基在37 ℃摇菌过夜。质粒提取试剂盒购买自天根公司，按照protocol操作，质粒冻存于-20 ℃。使用LipofectamineTM3000转染后T24以及5637细胞48 h后，用实时荧光定量PCR法检测UPF1 mRNA相对表达水平，用WB法检测UPF1蛋白表达水平，验证UPF1过表达质粒的表达效率。

1.5 CCK-8实验

CCK-8实验用于检测细胞增殖能力，将不同处理的细胞以同样的数目铺入96孔板中，每组设置6个复孔，分别在培养1、2、3、4、5 d后使用CCK-8试剂盒检验各组细胞增殖能力。重复实验3次，绘制细胞生长曲线。

1.6 平板克隆实验

细胞转染48 h后，按每孔300个细胞铺入6孔板，每组设置3个复孔，并轻轻摇动使细胞分散均匀。置37 ℃，5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养至出现肉眼可见的克隆群落时。结晶紫染色后计数。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.7 Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力

使用8 μm涂有或未涂有Matrigel的小室(BD Biosciences)评估细胞的迁移和侵袭能力。将Transwell小室置于24孔细胞板中，每组设3个复室，按每个小室10万个细胞往上室中加入含细胞的无血清PRMI-1640培养基200 uL，下室中加入含有10%胎牛血清的1 640完全培养基600 uL，放入培养箱中培养。培养适当时间后，用4%多聚甲醛溶液室温固定穿到下室的细胞，0.1% 结晶紫染色液染色。使用倒置显微镜对来自3次重复迁移和侵袭测定的每一个的6个随机区域进行拍照计数。

1.8 WB法检测UPF1过表达对细胞中相关蛋白的表达的影响

转染48 h后，用RIPA裂解液提取细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白质浓度。使用8% SDS-PAGE胶，每个孔上样50 μg蛋白质进行电泳，电泳分离的蛋白质用湿转法转移至PVDF 膜上，配置5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭2 h，封闭完成后用TBST轻轻漂洗2次条带，把条带放入用一抗稀释液稀释的一抗中，4 ℃反应过夜；TBST 漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(二抗，体积稀释比例为1∶5 000)，室温下置于摇床上1 h；TBST漂洗3次，用ECL试剂发光；在Bio-Rad 凝胶成像仪中显影，采用Image J软件分析蛋白质条带的灰度值，以目的蛋白与内参照GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 UPF1在生物信息库中膀胱癌组织中表达上调

使用GEPIA 数据库(http：//gepia.cancerpku.cn/)和ONCOMINE数据库(https://www.oncomine.org/)分析UPF1在膀胱癌组织以及正常膀胱组织中的表达差异，结果分别如图1.A和B所示，GEPIA数据库和ONCOMINE数据库显示相比于正常膀胱组织，膀胱癌的UPF1表达更高。

7.06.56.05.55.54.54.0UPF1表达水平膀胱癌组织(n=404)正常膀胱组织(n=28)3.53.02.52.01.51.00.50.0ABUPF1表达水平正常膀胱组织(n=48)膀胱癌组织(n=28)

2.2 UPF1过表达质粒转染后细胞中UPF1 mRNA和蛋白表达水平上调

分别转染UPF1过表达质粒和空白载体至5637和T24细胞48 h后，应用实时荧光定量PCR法(实时荧光定量PCR)和蛋白质印迹法(WB)分别检测细胞中UPF1 mRNA 和蛋白的表达水平。实时荧光定量PCR结果如图2A所示，5637和T24细胞中的UPF1过表达组UPF1 mRNA的表达水平明显高于空载体组(P均< 0.01)；WB结果如图2B所示，5637和T24细胞中的UPF1过表达组的UPF1蛋白的表达水平明显高于空载体转染组(P均< 0.01)。以上结果提示，UPF1在5 637和T24细胞的UPF1过表达组中被有效过表达。

AB80070060050080757065605432102.01.51.00.50.05637NC5637OVT24NCUPF1mRNA表达水平T24OVTNTO5N5O5637NC5637OVT24NCT24OVUPF1GAPDH**UPF1蛋白质表达水平

2.3 过表达UPF1可增强膀胱癌细胞的增殖能力

细胞转染24 h后，计数铺板，分别培养24、48、72、96、120 h，用酶标仪测定各组细胞吸光度，吸光度越高代表细胞数量越多，生长速度越快，增殖能力越强。图3A和3B中，5637和T24细胞中的UPF1过表达组的OD值增高速度较对照组快，提示过表达UPF1可增强5637和T24细胞的生长速度(P<0.01)，说明过表达UPF1可增强膀胱癌细胞的体外增殖能力。

432102.52.01.51.00.50.02448729612024487296120**5637NC5637OVABT24NCT24OV细胞活性A450细胞活性A450

2.4 过表达UPF1可增强膀胱癌细胞的克隆形成能力

细胞转染24 h后，计数铺板，培养至形成肉眼可见的菌落，通过计算克隆形成率检测细胞的克隆形成能力。图4A中5637细胞UPF1过表达组的菌落数较对照组多，提示过表达UPF1可增强5637细胞的克隆形成能力；图4B中T24细胞UPF1过表达组的菌落数目较对照组多(P<0.05)，提示过表达UPF1可增强T24细胞的克隆形成能力。

5637NC5637OVT24NCT24OV*5637T24NCOV*100806040200NumberofcoloniesBA

2.5 过表达UPF1可增强膀胱癌细胞的迁徙侵袭能力

细胞转染48 h后，计数细胞铺入小室，通过比较穿过小室的细胞量研究UPF1对膀胱癌细胞的迁移侵袭能力。图5.A和B中，5637和T24细胞中的UPF1过表达组的细胞数量较对照组明显增多(P<0.01)，提示过表达UPF1可增强5637和T24细胞的迁移侵袭能力。

5637T24NCOVNCOV****NCOVNCOV侵袭迁移5637T241000800600400200010008006004002000细胞数AB细胞数侵袭迁移侵袭迁移

2.6 过表达UPF1可增强划痕实验检测细胞迁移能力

进一步通过划痕实验检测UPF1对细胞迁移能力的影响，实验结果如图6A：可见过表达UPF1组较对照组细胞伤痕愈合速度快。图6B通过Image J软件计算伤口愈合百分比，统计分析，差异存在统计学意义，表明过表达UPF1可以增强膀胱癌细胞的迁移能力。

5637NC5637OVT24NCT24OV0h24h**T24OVT24NC5637OV5637NC806040200伤口愈合百分比(%)AB

2.7 UPF1蛋白的互作蛋白网络

利用Genemania网站(http://genemania.org/)和STRING网站(https://string-db.org)在线预测UPF1的相互作用蛋白，分析UPF1调控膀胱癌发生发展的细胞信号通路，如图7A和B所示，我们发现UPF1与AKT和mTOR蛋白存在间接联系。

AB

2.8 UPF1能影响AKT/mTOR信号通路变化

细胞转染pcDNA3.1-UPF1，48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白，通过western blot检验AKT/mTOR信号相关蛋白的改变。结果如图8所示。结果显示，在膀胱癌细胞株5637和T24中，过表达UPF1引起AKT和mTOR的变化。与对照组相比，5637、T24细胞中过表达UPF1后，AKT的磷酸化水平增加，即p-AKT的表达量增加，进而提高p-mTOR的表达量，即磷酸化水平增加，从而激活AKT/mTOR信号通路。

5637NC5637OVT24NCT24OVp-mTOR289kDamTOR289kDap-AKT56kDaAKT56kDaUPF1124kDaGAPDH36kDaNCOV******5637T242.01.51.00.50.02.01.51.00.50.0相对蛋白表达水平p-AKTAKTp-mTORmTORUPF1p-AKTAKTp-mTORmTORUPF1NCOVAB相对蛋白表达水平

3 讨 论

NMD与癌变之间的关系很复杂，可能取决于肿瘤类型和进展阶段。比如在肿瘤发生阶段，NMD通过降解突变mRNA抑制了某些突变的抑癌基因的表达，有研究报道遗传性弥漫性胃癌约80%编码E-cadherin的基因CDH1发生突变，NMD降解CDH1导致有抑癌作用的E-cadherin下调进而促进了早期致癌作用[20]。而UPF1作为NMD中最关键的蛋白质，在肿瘤中的作用也引起了广泛的注意。最近研究报道了UPF1在前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤多种肿瘤中扮演着不同的角色[11-19]。

在本研究中，我们体外构建了UPF1过表达质粒，通过脂质体LipofectamineTM3000转染膀胱癌5637细胞和T24细胞，使其过表达UPF1。实时荧光定量PCR和WB实验结果表明UPF1过表达组的UPF1 mRNA和蛋白表达水平均显著提高，提示UPF1过表达质粒可以有效过表达UPF1。为了解UPF1对膀胱癌的意义，我们用膀胱癌5637细胞和T24细胞的UPF1过表达组细胞与对照组细胞进行了CCK-8实验、平板克隆形成实验、Transwell小室迁徙与侵袭实验，实验结果表明过表达UPF1可以增强膀胱癌细胞的增殖能力、克隆形成能力和迁移侵袭能力，提示UPF1可以调控膀胱癌的发生发展。

TCGA数据显示42%的膀胱癌样本中有PI3K/AKT/mTOR信号通路相关异常，当生长因子、激素或营养物质等激活PI3K时，产生磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PIP3随后结合至Akt1，招募的Akt1至细胞膜磷酸化。激活的Akt1通过直接磷酸化GTPase激活蛋白TSC2，使由TSC1和TSC2组成的结节性硬化复合物(TSC)失活。当从TSC抑制中释放时，Rheb蛋白便可以激活mTOR。进而调控包括细胞周期进程，细胞增殖，血管生成和凋亡等细胞生理活动，从而使肿瘤进一步生长发育[21-27]。

通过Genemania网站(http://genemania.or/)和STRING网站(https://string-db.org/)在线预测UPF1与其他蛋白的互作关系，发现UPF1与AKT蛋白和mTOR蛋白之间相互联系。因此，猜测UPF1主要通过PI3K/AKT/mTOR信号通路影响膀胱癌发生发展。WB实验结果显示UPF1过表达可以增加p-AKT和p-mTOR的表达量,通过提高AKT蛋白和mTOR蛋白的磷酸化水平，从而促进膀胱癌增殖迁移侵袭。

综上所述，UPF1作为膀胱癌进展过程中的重要调控因子，通过调控mTOR和AKT的磷酸化进程，进而促进膀胱癌细胞增殖迁移侵袭。因此，对UPF1进行针对性的研究，可能为临床治疗膀胱癌进展找到一条新的标志物或者治疗方案。