双藤汤醇提取物治疗去势骨质疏松症大鼠的实验研究*

魏根红，王上曾，田明波，郭国兴，郭小伟

1.平顶山市中医医院，河南 平顶山 467000；2.河南省中医院，河南 郑州 450002；3.郑州市人民医院，河南 郑州 450015；4.郑州市骨科医院，河南 郑州 450052

骨质疏松症是一种以骨量减少，骨微结构破坏，骨密度降低等为特征的慢性骨骼疾病，在绝经后女性中多见［1］。据统计，我国60岁以上老年人骨质疏松症患病率高达30%～50%，其中60～70岁绝经后女性的患病率高达50%～70%［2］。临床治疗骨质疏松的药物主要有雌激素类药物、双膦酸盐、钙剂等，其中雌激素替代疗法目前在临床最常见，虽然该方法具有一定疗效，但会增加乳腺癌、心脑血管疾病等的发病风险［3］。因此，寻找副作用低，疗效稳定的替代药物尤为重要。双藤汤由雷公藤和黑骨藤组成，雷公藤是卫矛科植物，具有祛风除湿、消肿止痛的功效，可改善骨微结构，促进骨折愈合［4］。黑骨藤是萝藦科植物，具有活血消痈、祛风除湿的功效，可抑制破骨细胞分化，抑制骨吸收［5］。二者均能改善骨质疏松症的相关临床症状，但双藤汤能否治疗骨质疏松症尚未见文献报道，因此，本研究建立去势骨质疏松大鼠模型，探讨双藤汤醇提取物对其的疗效及相关作用机制，为双藤汤在骨质疏松症临床治疗中的应用提供理论依据。

1 材料

1.1 动物60只3月龄SPF级SD雌鼠，体质量260～280 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2019-0001。饲养条件：温度18～26℃，相对湿度40%～60%，12 h/12 h昼夜循环，自由饮食、饮水。

1.2 药物与试剂雷公藤木质部、黑骨藤（亳州仁益中药材销售有限公司，批号：190613、190528）；阿仑膦酸钠片（美国默沙东公司，规格：70 mg/片，批号：20190215A）；青霉素［华北制药股份有限公司，规格：0.48 g（80万U），批号：201904］。多聚甲醛、硝酸溶液（唐山中浩化工有限公司，货号：135876、132691）；细胞裂解液（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：201806）；反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：G1023507）；大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）、Ⅰ型胶原交联C-末端肽（C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen，CTX-1）、骨钙素（bonegla protein，BGP）、I型前胶原N端前肽（type I procollagen propeptide，PINP）ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：R190124、R190610、R190511、R190420）；苏木素伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：20190415007）；Trizol（美国Invitrogen公司，批号：190412Y）；二喹啉甲酸法（bicin choninic acid，BCA）试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司，批号：20190513）；荧光预混液（美国TaqMan公司，批号：190508C）；骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）兔单克隆抗体及二抗（美国Abcam公司，批号：190216、190328、190410；190425、190427、190521）；β-actin蛋白一抗及二抗（南京博研生物科技有限公司，货号：P0416112、P0528147）；引物合成委托苏州金唯智生物科技有限公司。

1.3 仪器UltraFocus型小动物双能X线骨密度诊断仪（美国Faxitron公司）；TDZ5-BP型医用离心机（长沙湘锐离心机有限公司）；xMark酶标仪（美国Bio-Rad公司）；9500型实时逆转录聚合酶链反应（real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）仪（美国ABI公司）；LV-150N型光学显微镜（日本尼康公司）；DYCZ-30C型蛋白凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统（美国Bio-Rad公司）；CA288型全自动凝胶成像分析系统（上海精密仪器仪表有限公司）。

2 方法

2.1 双藤汤醇提取物制备将15 g雷公藤和9 g黑骨藤混合后粉碎，加入80%乙醇，50℃加热回流提取，可得双藤汤醇提取物（1 g醇提取物相当于5 g生药量）。

2.2 模型建立及分组给药3月龄的SPF级SD雌鼠60只，随机分为假手术组、模型组、阿仑膦酸钠组、双藤汤醇提取物高剂量组、双藤汤醇提取物中剂量组、双藤汤醇提取物低剂量组，每组10只。采用2%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，打开大鼠腹腔，暴露卵巢组织，在卵巢根部结扎并摘除双侧卵巢，假手术组大鼠仅切除卵巢附近脂肪组织，不切除卵巢，手术完成后缝合。术后每只大鼠每天注射1.0×105U的青霉素预防感染，连续3 d。3个月后，采用双能X线骨密度诊断仪检测大鼠股骨骨密度，大鼠骨密度值比建模前下降30%以上，认为去势骨质疏松症大鼠模型建模成功。建模成功后，双藤汤醇提取物高、中、低剂量组分别灌胃给予2 mL不同浓度的双藤汤醇提取物（161 g·L-1、80.5 g·L-1、40.25 g·L-1），阿仑膦酸钠组灌胃给予2 mL浓度为50 g·L-1的阿仑膦酸钠溶液，假手术组和模型组均灌胃给予等体积的生理盐水，每日1次，连续2个月。

2.3 大鼠骨密度检测采用双能X线骨密度诊断仪分别于治疗前、治疗后检测大鼠左侧股骨和胫骨骨密度值。大鼠麻醉后，将待测部位固定在扫描仪探头下，通过骨密度测定软件，分析待测部位骨密度值。

2.4 ELISA法检测大鼠骨代谢水平分别在治疗前和治疗后，采用ELISA法检测大鼠血清中TRAP、CTX-1、BGP、PINP的水平。取大鼠尾静脉血，室温静置2 h后，3 000×g离心20min分离血清，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测各样本孔光密度（optical density，OD）值，依据标准蛋白浓度与OD值得到回归方程，并绘制标准曲线，根据样本孔OD值，计算出对应蛋白浓度。

2.5 股骨形态学观察通过HE染色观察大鼠股骨病理变化。取大鼠股骨组织，4%多聚甲醛固定48 h，5%硝酸脱钙处理1周后进行石蜡包埋。将组织蜡块切成厚度4μm的组织切片，经过脱蜡复水后，按照HE染色试剂盒说明书对切片进行HE染色，经过中性树脂封片后，光镜下观察大鼠股骨病理变化。

2.6 RT-qPCR检测大鼠股骨组织中OPG mRNA、RANKL mRNA、NF-κB m RNA的表达水平采用RT-qPCR检测大鼠股骨组织中OPG mRNA、RANKL mRNA、NF-κB mRNA的相对表达量。取大鼠股骨组织，加入少许液氮研磨成粉末状，Trizol法提取股骨组织总RNA，依据反转录试剂盒说明书操作反转录成cDNA。根据美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）基因库中查询目的基因mRNA序列设计出上下游引物。引物序列见表1。以β-actin为内参基因，通过配套荧光分析软件分析样本Ct值，按照2-△△Ct计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 引物序列

2.7 Western Blot检测大鼠股骨组织中OPG、RANKL、NF-κB蛋白的表达水平采用Western blot检测大鼠股骨组织中OPG、RANKL、NF-κB蛋白的表达水平。取大鼠股骨组织加入少许液氮研磨，加入细胞裂解液，置于4℃裂解过夜。10 000×g离心10 min，取上清，即为总蛋白。采用BCA试剂盒进行蛋白质定量，沸水中变性5 min。蛋白上样进行凝胶电泳。经过封闭，一抗（稀释比例1∶1 000、1∶2 000、1∶1 000）、二抗（稀释比例均为1∶5 000）杂交后显色，根据图像分析系统对目的条带进行灰度值分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达水平。

2.8 统计学方法使用SPSS 22.0对实验结果进行统计学分析，实验数据使用平均值±标准差（±s）表示，多组间比较使用单因素方差分析，两两比较使用SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠骨密度的影响造模结束后检测发现，模型组和阿仑膦酸钠组均有1只造模不成功，后续实验将其舍弃。治疗前，与假手术组比较，造模大鼠股骨和胫骨骨密度显著下降（P＜0.05）。治疗后，与假手术组比较，模型组大鼠股骨和胫骨骨密度均显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，双藤汤醇提取物高、中、低剂量组大鼠股骨和胫骨骨密度显著升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性。见表2。

表2 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠骨密度的影响 （±s）

表2 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠骨密度的影响 （±s）

注：与假手术组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；与治疗前比较，△P＜0.05

-2组别 n 股骨/g·cm-2胫骨/g·cm治疗前 治疗后假手术组治疗前 治疗后10 0.29±0.02 0.28±0.02 0.24±0.02 0.23±0.01模型组 9 0.22±0.01a 0.21±0.01a 0.19±0.01a 0.18±0.01a阿仑膦酸钠组 9 0.21±0.01a 0.25±0.01b△ 0.19±0.01a 0.21±0.01b△双藤汤醇提取物高剂量组 10 0.21±0.01a 0.26±0.01b△ 0.19±0.01a 0.23±0.02b△双藤汤醇提取物中剂量组 10 0.22±0.01a 0.25±0.01b△ 0.19±0.01a 0.21±0.01b△双藤汤醇提取物低剂量组 10 0.21±0.01a 0.23±0.02b△ 0.19±0.02a 0.19±0.01b △

3.2 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠骨代谢的影响治疗前，与假手术组比较，各造模大鼠血清中TRAP、CTX-1的水平显著升高（P＜0.05），BGP、PINP的水平显著降低（P＜0.05）。治疗后，与假手术组比较，模型组大鼠血清中TRAP、CTX-1的水平显著升高（P＜0.05），BGP、PINP的水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组大鼠血清TRAP、CTX-1的水平显著下降（P＜0.05），而BGP、PINP的水平显著升高（P＜0.05），且双藤汤醇提物的作用效果呈现明显的剂量依赖性。见表3。

表3 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠骨代谢的影响 （±s）

表3 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠骨代谢的影响 （±s）

注：与假手术组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05；与治疗前比较，△P＜0.05

-1分组 n TRAP/U·L CTX-1（ρ/μg·L-1）BGP（ρ/μg·L-1）PINP（ρ/μg·L-1）治疗前 治疗后假手术组 10 4.24±0.44 4.36±0.47 113.68±0.35 111.62±7.51 38.91±6.02 38.69±5.65 33.25±4.01治疗前 治疗后治疗前 治疗后治疗前 治疗后35.17±5.25模型组 9 9.33±1.06a 9.41±0.81a 184.68±10.50a 185.74±9.82a 18.12±1.96a 16.52±3.56a 14.33±2.58a 13.89±2.11a阿仑膦酸钠组 9 9.41±0.69a 6.35±0.29b△ 185.71±9.12a 153.68±7.55b△17.98±3.05a 27.50±4.01b△ 13.92±2.20a 24.50±3.06b△双藤汤醇提取物高剂量组10 9.35±1.93a 5.28±0.96b△ 187.02±7.65a 130.74±9.48b△18.15±2.89a 20.93±2.09b△ 14.04±1.74a 29.48±4.24b△双藤汤醇提取物中剂量组10 9.37±1.63a 6.38±1.38b△ 182.90±8.23a 150.01±6.58b△17.66±2.68a 26.81±3.51b△ 13.65±2.66a 23.92±3.29b△双藤汤醇提取物低剂量组10 9.40±0.90a 8.08±0.75b△ 191.22±9.29a 167.82±5.61b△18.09±1.06a 32.44±2.36b△ 14.23±3.15a 18.36±2.68b△

3.3 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织形态学的影响假手术组大鼠骨小梁分布均匀致密，无明显变细，结构完整，骨髓腔较小。模型组大鼠骨小梁出现断裂，连续性差，骨髓腔明显增大。与模型组比较，双藤汤醇提取物高、中、低剂量组大鼠股骨组织骨小梁面积增大，结构完整，骨髓腔减小。见图1。

图1 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织形态学的影响（HE染色，×400）

3.4 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织中OPG mRNA、RANKL mRNA及NF-κB mRNA表达水平的影响与假手术组比较，模型组大鼠RANKL mRNA、NF-κB mRNA的表达水平显著升高（P＜0.05），OPG mRNA的表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，双藤汤醇提取物给药组大鼠RANKL mRNA、NF-κB mRNA的表达水平显著降低（P＜0.05），OPG mRNA的表达水平显著升高（P＜0.05），且双藤汤醇提物的作用效果呈现明显的剂量依赖性。见表4。

表4 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织中OPG m RNA、RANKL m RNA及NF-κB m RNA表达水平的影响 （±s）

表4 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织中OPG m RNA、RANKL m RNA及NF-κB m RNA表达水平的影响 （±s）

注：与假手术组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

mRNA假手术组分组 n OPG mRNA RANKL mRNA NF-κB 3 0.68±0.12 0.52±0.06 0.41±0.07模型组 3 0.22±0.06a 1.21±0.15a 0.95±0.12a阿仑膦酸钠组 3 0.45±0.05b 0.84±0.11b 0.66±0.06b双藤汤醇提取物高剂量组3 0.59±0.06b 0.69±0.05b 0.53±0.05b双藤汤醇提取物中剂量组3 0.47±0.08b 0.82±0.09b 0.68±0.05b双藤汤醇提取物低剂量组3 0.31±0.07b 1.03±0.12b 0.83±0.09 b

3.5 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表达水平的影响与假手术组比较，模型组大鼠股骨组织中RANKL、NF-κB蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.05），OPG蛋白的相对表达量显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，双藤汤醇提取物高、中、低剂量组大鼠股骨组织RANKL、NF-κB蛋白相对表达量显著下降（P＜0.05），OPG蛋白的相对表达量显著升高（P＜0.05），且双藤汤醇提取物的作用效果呈明显的剂量依赖性。见图2，表5。

图2 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表达的影响（Western blot检测）

表5 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表达水平的影响 （±s）

表5 双藤汤醇提取物对去势骨质疏松症大鼠股骨组织中OPG、RANKL及NF-κB蛋白表达水平的影响 （±s）

注：与假手术组比较，a P＜0.05；与模型组比较，b P＜0.05

组别 n OPG RANKL NF-κB 3 0.82±0.12 0.69±0.09 0.39±0.05模型组 3 0.33±0.08a 1.56±0.25a 1.25±0.11a阿仑膦酸钠组 3 0.59±0.10b 1.05±0.18b 0.72±0.06b双藤汤醇提取物高剂量组3 0.70±0.04b 0.83±0.09b 0.58±0.06b双藤汤醇提取物中剂量组3 0.57±0.09b 1.08±0.12b 0.70±0.12b双藤汤醇提取物低剂量组3 0.45±0.11b 1.32±0.20b 1.03±0.09假手术组b

4 讨论

绝经后骨质疏松症是由于女性卵巢功能低下，雌激素分泌减少，激发了破骨细胞活性，导致机体骨量减少、骨微结构退化、骨脆性增加而引起的，从而使骨折风险增高［6-8］。目前，骨质疏松症的治疗常以补钙、改善骨代谢、预防骨折为主，阿仑膦酸钠可抑制破骨过程，保护骨结构，提高骨密度，有效治疗骨质疏松并预防骨质疏松性骨折［9-10］。因此，本研究选择阿仑膦酸钠作为阳性对照药物。中药在骨质疏松症临床治疗中运用较广，常见药物有淫羊藿、骨碎补、地黄等［11-12］。研究表明，双藤汤对膝骨关节炎具有一定治疗效果［13］，但对骨质疏松症的疗效尚未可知。因此，本研究使用双藤汤治疗去势大鼠骨质疏松症，并初步探讨其作用机制，为临床治疗提供新的参考。

TRAP和CTX-1反映骨吸收水平。TRAP是破骨细胞标志酶，其活性可以衡量骨吸收能力［14-15］。CTX-1是反Ⅰ型胶原蛋白的代谢产物，是骨吸收水平的另一特异性指标。研究表明，在骨质疏松患者血清中可检测出TRAP和CTX-1水平异常升高［16］。本研究显示，骨质疏松模型大鼠TRAP和CTX-1水平显著升高，而双藤汤醇提取物治疗后，TRAP和CTX-1的水平显著降低，提示双藤汤具有抑制骨吸收的作用。BGP、PINP反映骨形成指标［17］，其中BGP是成熟成骨细胞中分泌的钙结合肽，血清中BGP水平可以反映成骨细胞活性［18］。Ⅰ型胶原主要在骨组织中合成，首先合成原胶原，在I型原胶原的氨基N端和C端各有1个延长肽，其中N端的延长肽即被称为PINP，当I型原胶原被成骨细胞分泌至细胞外，PINP被蛋白酶切割，进入血液循环［19-20］，因此，PINP可准确反映成骨细胞的活性。本研究显示，去势骨质疏松症大鼠血清中BGP、PINP的水平均显著降低，而经双藤汤醇提取物治疗后，BGP、PINP的水平显著升高，表明双藤汤醇提取物可促进骨形成。此外，本研究检测大鼠骨密度发现，经双藤汤醇提取物治疗后，骨质疏松症大鼠骨密度显著增加，且骨病理形态明显改善，表明双藤汤醇提取物对去势骨质疏松大鼠有治疗效果。

OPG是RANKL的诱饵受体，主要由骨髓基质细胞、成骨细胞等分泌，可与RANK竞争性结合RANKL，从而诱导破骨细胞凋亡，抑制骨吸收［21-22］。研究表明，OPG基因敲除小鼠骨吸收能力增强，出现严重骨质疏松症［23］。而RANKL基因过表达小鼠会出现骨密度降低，骨脆性增大［24］。此外，RANKL表达水平还可影响骨代谢［25］，RANKL表达水平升高可引起TRAP和CTX-1水平升高，BGP、PINP水平下降［26］。NF-κB是OPG下游靶基因，当OPG表达下降、RANKL表达升高时，NF-κB被激活，进而参与骨破坏，在骨质疏松症发生和发展过程中均有重要作用［27］。研究表明，在骨质疏松动物模型中可检测出NF-κB异常活化，而NF-κB基因敲除大鼠则表现出破骨细胞减少，引起骨硬化［28］。本研究显示，经过双藤汤醇提取物治疗后，大鼠股骨组织中OPG水平升高，RANKL、NF-κB水平降低，推测双藤汤醇提取物通过上调OPG表达，抑制RANKL、NF-κB表达治疗去势骨质疏松症大鼠。

综上所述，双藤汤醇提取物可提高去势骨质疏松症大鼠的骨密度，改善骨代谢水平和骨组织病变，其机制可能与上调OPG表达，抑制RANKL、NF-κB表达有关。本研究仅通过动物实验验证双藤汤醇提取物对骨质疏松大鼠的治疗效果，但双藤汤醇提取物在临床治疗骨质疏松的疗效及可行性尚未讨论，仍需进一步研究。