miR-491-5p靶向CCL22对舌鳞状细胞癌细胞增殖及凋亡的影响

汤丹萍 程志刚 邓少林

(武汉市中心医院口腔科，湖北 武汉 430000)

舌鳞状细胞癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，其新发病例逐年增加，威胁着人类的健康和生命〔1,2〕。趋化因子配体(CCL)22是趋化因子组的成员之一，也称为巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)，由单核细胞和树突细胞表达〔3〕。它主要由单核细胞来源的M2巨噬细胞合成，属于CC族趋化因子，CCR4是CCL22的受体，在调节性T细胞(Tregs)和Th2细胞中表达，这在肿瘤治疗中有一定的潜力〔4〕。据报道，CCL22在肿瘤微环境中的表达通过影响M1和M2样巨噬细胞的平衡，导致舌鳞状细胞癌患者预后恶化〔5,6〕。CCL22对舌鳞状细胞癌细胞的细胞表型变化和肿瘤生长的影响尚未可知。miR-491-5p在多种癌症中均出现表达失调〔7～10〕，但是miR-491-5p与CCL22在舌鳞状细胞癌之间的关系尚未清楚。本研究旨在研究miR-491-5p对细胞增殖、凋亡的调控机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物SPF级BALB/C裸鼠(18～20 g)30只，购自湖南斯莱克实验生物有限公司，遵守实验动物管理和伦理委员会章程对动物进行饲养和相关实验；人正常口腔角质细胞培养NHOK、人舌癌细胞TCA8113、UM1、SCC1均购自美国菌种保藏中心(ATCC)；杜氏培养基(DMEM)购自Gibco；胎牛血清购自Hyclone；噻唑蓝(MTT)购自上海克拉玛尔；LipofectamineTM2000购自北京宜科思源科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自上海通蔚公司；逆转录试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自Roche；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 试剂盒、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒均购自北京索莱宝公司；电化学发光(ECL)试剂盒购自北京普利莱基因技术公司；RIPA蛋白裂解液购自BestBio；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 细胞培养均用DMEM培养液(10%胎牛血清)进行培养，条件为：37℃、5% CO2的恒温培养箱进行常规培养。

1.2.2细胞的分组 将正常培养的TCA8113细胞随机分为miR-NC组、miR-491-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-491-5p组、si-NC组、si-CCL22组、miR-491-5p+pc DNA组、miR-491-5p+pc DNA-CCL22组。处理方法：将miR-NC、miR-491-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-491-5p、si-NC、si-CCL22、miR-491-5p mimics+pcDNA、miR-491-5p mimics+pc DNA-CCL22，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书要求转染至TCA8113细胞，转染6 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，qRT-PCR检测细胞的转染效率。转染成功后，用于后续试验。

1.2.3RT-qPCR实验 取适量需要检测的细胞，用RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒提取细胞的总RNA并合成cDNA，将其用RT-qPCR试剂盒进行miR-491-5p、CCL22的检测。结果以U6和GAPDH为内参，2-△△Ct法检测计算miR-491-5p、CCL22的表达。引物序列：miR-491-5p：上游引物GGAGTGGGGAACCCTTCC，下游引物GTGCAGGGTCCGAGGT；内参U6：上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT；CCL22上游引物：GGCACCTATCCAGTGCCACA，下游引物TGGTGGACCAGCCTGAAACTC；内参GAPDH：上游引物TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，下游引物TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG。

1.2.4Western印迹 取适量需要检测的细胞或充分研磨的组织匀浆，用蛋白裂解液充分裂解，再用BCA定量试剂盒进行定量，沸水浴变性后取上清进行SDS-PAGE。电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜，再将膜依次进行脱脂奶粉(2.5%，2 h)封闭、一抗孵育(4℃，过夜)和二抗孵育(37℃，1.5 h)。结束后用ECL发光液进行显影曝光。结果以GAPDH为内参，目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的表达。

1.2.5MTT实验 收集需要检测的细胞，调至105个/ml，取100 μl接种至24孔板，每孔加入20 μl的MTT溶液，37℃孵育4 h，再加入150 μl的 DMSO，约2 min至完全溶解。设置酶标仪波长为490 nm，检测细胞的吸光度(A)。

1.2.6流式细胞术 将需要检测的细胞用结合缓冲液悬浮，待用。按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书要求操作，加入Annexin V-FITC和PI，反应20 min，尽快上流式细胞仪检测分析结果。

1.2.7双荧光素酶报告基因检测实验 通过网站Target Scan(http://www.targetscan.org/)预测到miR-491-5p与CCL22之间存在互补的结合位点，为了验证这一预测，将CCL22 3′UTR-WT(含野生型CCL22 3′UTR片段)和CCL22 3′UTR-MUT(含突变的CCL22 3′UTR片段)荧光素酶报告载体，分别与miR-491-5p、miR-NC共转染，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作，记录萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶激发值，以两者的比值评价miR-491-5p与CCL22的结合力。

1.2.8裸鼠成瘤实验 把SPF裸鼠分为control组、si-NC组和si-CCL22组，每组10只。用1 ml注射器吸取0.2 ml浓度为1×106个/ml的癌细胞，碘伏消毒后，裸鼠右前肢接种肿瘤，SPF环境下继续饲养。接种后第3天开始，每周1次测量肿瘤的长a(cm)和宽b(cm)，约第45天，肿瘤生长已较大。断颈法处死裸鼠，小心剥下瘤子，称重。肿瘤体积的计算为V=a×b2×0.52(cm3)，取平均值。

1.3统计学方法 采用PEMS3.2软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、t检验。

2 结 果

2.1miR-491-5p、CCL22在舌鳞状细胞癌细胞中的表达 与NHOK组相比，TCA8113组、UM1组、SCC1组舌鳞状细胞癌细胞中miR-491-5p mRNA表达明显降低，CCL22 的mRNA表达和蛋白表达均明显升高(P<0.05)。其中TCA8113细胞的变化最大，故选用该细胞用于后续研究。见图1，表1。

图1 CCL22在舌鳞状细胞癌细胞中的蛋白表达

表1 miR-491-5p、CCL22在舌鳞状细胞癌细胞中的表达

2.2过表达miR-491-5p对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响 与miR-NC组相比，miR-491-5p组TCA8113细胞miR-491-5p mRNA表达显著升高，在48、72 h时，细胞增殖显著降低，细胞凋亡率显著升高(均P<0.05)。见图2，表2。

2.3miR-491-5p靶向CCL22 miR-491-5p的5′UTR端存在7个与CCL22的3′UTR端互补的核苷酸序列，见图3。与miR-NC组相比，miR-491-5p组WT-CCL22细胞的荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，见表3。与anti-miR-NC组CCL22蛋白(0.99±0.04)相比，anti-miR-491-5p组(2.01±0.14)显著升高，与miR-NC组CCL22蛋白(1.00±0.66)相比，miR-491-5p组(0.38±0.01)显著降低(P<0.05)。见图4。

图2 过表达miR-491-5p的舌鳞状细胞癌细胞凋亡

表2 过表达miR-491-5p对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

图3 miR-491-5p与CCL22的靶向结合位点

表3 双荧光素酶报告基因检测实验结果

2.4敲减CCL22对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响 与si-NC组相比，si-CCL22组TCA8113细胞CCL22蛋白表达明显降低，在48、72 h时，细胞增殖明显降低，细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见图5，表4。

1～4：anti-miR-NC组，anti-miR-491-5p组，miR-NC组，miR-491-5p组

图5 敲减CCL22的舌鳞状细胞癌细胞中CCL22蛋白表达

表4 敲减CCL22对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

2.5敲减CCL22抑制裸鼠成瘤 与si-NC组相比，si-CCL22组肿瘤组织CCL22蛋白表达明显降低，肿瘤质量和体积也均明显降低(P<0.05)。见图6，表5。

图6 裸鼠成瘤中CCL22的蛋白表达

2.6过表达CCL22逆转miR-491-5p对舌鳞状细胞癌细胞的增殖抑制和凋亡促进作用 与miR-491-5p+pc DNA组相比，miR-491-5p+pc DNA-CCL22组TCA8113细胞中miR-491-5p mRNA表达明显降低，在48、72 h时，细胞增殖明显升高，细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。见表6。

表5 敲减CCL22对肿瘤生长的影响

表6 过表达CCL22逆转了过表达miR-491-5p对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的调控

3 讨 论

miRNA在各种肿瘤中的功能已得到国内外的普遍认可，包括头颈部肿瘤〔11,12〕。Huang等〔13〕在口腔鳞状细胞癌的研究中报道，miR-491-5p表达异常降低，与患者总体存活率低显著相关，G蛋白耦联受体激酶相互作用蛋白(GIT)1为miR-491-5p的靶标，过表达miR-491-5p可抑制口腔鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭，揭示miR-491-5p是口腔鳞状细胞癌预后的生物标志物。Zheng 等〔14〕发现，miR-491-3p在耐药舌癌中的表达水平显著降低，过表达miR-491-3p可增强舌癌细胞对化学治疗的敏感性，miR-491-3p可靶向抑制mTORC2成分Rictor，低水平的miR-491-3p与舌癌患者的预后不良相关，揭示miR-491-3p/mTORC2信号通路的靶向干预提供了理论基础，增强化疗对舌癌的敏感性。本研究说明miR-491-3p对舌鳞状细胞癌细胞的细胞表型有调控作用，为舌鳞状细胞癌的诊断、治疗提供新的生物标志物；miR-491-3p在舌鳞状细胞癌中的功能机制与CCL22关系密切，为探索miR-491-3p在舌鳞状细胞癌中的调控机制提供参考。趋化因子是一种小的促炎趋化因子，在许多肿瘤相关的生长、转移和血管生成过程中发挥重要作用〔15,16〕。CCL22除了在先天免疫细胞活化和Th2中有肿胀效应外，在肿瘤发生发展中也有重要作用〔17〕。Kimura等〔6〕在舌鳞状细胞癌的研究中报道，CCL22的表达量与癌症的分级、患者总体存活率、CD8阳性细胞数量和肿瘤恶性指数显著相关，表明，CCL22在肿瘤微环境中的表达通过影响M1和M2样巨噬细胞的平衡导致舌鳞状细胞癌患者的预后恶化。本研究结果说明CCL22的下调可抑制舌鳞状细胞癌的恶化，提示CCL22抑制剂在抗舌鳞状细胞癌中的巨大潜力。

综上，miR-491-3p可抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖和舌鳞状细胞肿瘤的生长，促进凋亡，这与miR-491-3p靶向CCL22相关，为舌鳞状细胞癌的靶向治疗提供实验依据。