应用分子标记辅助选育低谷蛋白水稻新品种

田孟祥 何友勋 赵 龙 张时龙 余本勋 叶永印

（毕节市农业科学研究所 贵州毕节551700）

水稻在我国农作物中具有重要的地位， 是最主要的粮食作物之一， 我国60%以上的人口以稻米为主食。 稻米中蛋白质占 8%～10%，根据其溶解特性，可分为4 种， 即清蛋白、 球蛋白、 醇溶蛋白和谷蛋白[1]，以谷蛋白含量最高，约占总蛋白的80%，也是人体最易于消化吸收的蛋白成分，因此，可通过提高谷蛋白含量来增加稻米的营养价值。 然而，对于患有肾脏疾病的病人来说， 摄入大量的可吸收性蛋白会增加肾脏负担，导致人体蛋白代谢紊乱，进而造成病情恶化。 近年来，随着肾脏病患者人数不断增多，低谷蛋白含量水稻品种越来越受到人们的关注， 培育综合性状优良的低谷蛋白新品种已成为当前功能性水稻育种的一个重要方向。

日本学者通过诱变获得一个低谷蛋白突变体，该控制基因命名为Lgc1，将该突变体进行杂交，培育出世界第一个低谷蛋白水稻品种LGC1。 万建民等[2]引入LGC1 品种作为育种亲本，培育出了我国第一个低谷蛋白水稻品种W3660。 此后， 在我国水稻育种界，以含低谷蛋白基因Lgc1材料为亲本，选育出了一些低谷蛋白水稻新品种[3-7]。

本研究以从江苏省农业科学院粮食作物研究所引进的含低谷蛋白基因Lgc1的材料L06 为亲本，与课题组选育的12095B 进行杂交组配，后代在田间选择中，结合笔者[8]早年参与开发的Lgc1基因功能标记鉴定，选育出了低谷蛋白新品系，命名为TL0695。 该新品系综合性状优良、丰产性好，具有重要的应用价值，笔者将对其选育情况进行简述。

1 材料与方法

1.1 试验材料

母本：2014 年从江苏省农业科学院粮食作物研究所引进的含低谷蛋白基因Lgc1的材料L06。

父本：笔者课题组选育的保持系12095B。

1.2 试验方法

1.2.1 水稻DNA 的提取 水稻分蘖盛期， 单株挂牌， 取叶片， 将所取的叶片存于冰箱-20℃下备用。DNA 提取参照田孟祥等[9-11]的方法进行。

1.2.2 分子标记检测 分子标记及检测方法参照笔者[8]参与开发的Lgc1基因功能标记所述的方法进行。Lgc1基因功能标记由2 对引物构成， 即InDel-Lgc1-1和 InDel-Lgc1-2。 InDel-Lgc1-1： 正向引物序列5′-TTCTACAATGAAGGCGATGC-3′， 反向引物序列5′-CTGGGCTTTAACGGGACT-3′。 InDel-Lgc1-2：正向引物序列5′-ACCGTGTTATGGCAGTTT-3′，反向引物序列 5′-ATTCAAGGGCTATCGTCT-3′。 根据标记特性， 含纯合低谷蛋白Lgc1基因扩增881 bp 的带型，不含低谷蛋白基因扩增509 bp 的带型，而杂合体则扩增出以上2 种带型。

1.2.3 稻米谷蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝G-250 法进行稻米谷蛋白含量测定， 具体参照王艳平等[1]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 低谷蛋白新品系的选育过程

2014 年毕节正季以低谷蛋白种质L06 为母本，以12095B 为父本进行杂交，获F1，同年冬繁种于海南，移栽 20 株，成熟后种子混收，为 F2；2015 年毕节正季种植F2，移栽种植600 株，单株种植，挂牌，取叶片进行分子标记检测，熟后选农艺性状优良单株，收单穗，结合分子标记检测结果，留含目标基因植株的种子，15 个单穗，将种子互混保存，为F3，同年冬繁种于海南，移栽种植500 株，单株种植，挂牌，单株取叶片进行分子标记检测，熟后选农艺性状优良单株，收单穗，结合分子标记检测结果，留含目标基因植株的种子，20 个单穗，互混保存，为 F4；2016 年毕节正季种植F4，移栽400 株，单株种植，挂牌，单株取叶片进行分子标记检测， 熟后选农艺性状优良单株， 收单穗，结合分子标记检测结果，留含目标基因植株的种子，10 个单穗，单穗保存，为F5，同年冬繁种于海南，10 个单穗种植成10 个小区，每小区100 株，田间选择与分子标记辅助选择相结合，收单穗12 个，为F6；2017 年毕节正季种植F6，12 个单穗种成12 个小区，每小区100 株， 田间选择与分子标记辅助选择相结合，收单穗8 个，为F7，同年冬繁种于海南，8 个单穗种植成8 个小区，每小区100 株，田间选择与分子标记辅助选择相结合，收获单穗10 个，为F8；2018 年正季种植 F8，10 个单穗种植成 10 个小区， 收获 8 个单穗，经分子标记鉴定确认含目标基因，为F9，遗传稳定，同年海南南繁进行扩繁；2019 年正季参加品比试验，筛选出表现突出品系4 个；2020 年将上年4 个表现好的品种再参加品比试验， 最终选留综合表现最突出的低谷蛋白新品系1 个，暂定名为TL0695。

2.2 低谷蛋白基因分子标记鉴定

在低谷蛋白新品系选育过程中， 从基因分离的F2世代开始，应用Lgc1基因功能标记对目标基因进行跟踪。 低谷蛋白基因功能标记对F2群体植株的检测情况见附图，后面世代的检测大致与其相似，不再累赘。 由附图可知，L06/12095B 的 F2群体植株，在编号为 3～19 的单株中，编号为 10、11、13、14 仅有一条大小为881 bp 的带型，与亲本L06 的带型一致，是含低谷蛋白Lgc1纯合基因的植株；编号为 3、5、12、15、17 仅有一条大小为509 bp 的带型， 与亲本12095B的带型一致，是谷蛋白正常的植株；而编号为4、6、7、8、9、16、18、19 同时出现 881 bp 和 509 bp 的带型，为以上两类型植株的杂合体。

附图 低谷蛋白Lgc1 基因功能标记对L06/12095B 的F2 群体植株的检测

2.3 低谷蛋白含量测定

通过田间选择和分子标记辅助选择相结合，选育成了低谷蛋白新品系TL0659， 为了解其低谷蛋白的具体含量， 采用考马斯亮蓝 G-250 法测定其中碱溶性蛋白（谷蛋白）含量。 测定结果显示，所育成的低谷蛋白新品系TL0659 的谷蛋白含量为3.11%， 略低于母本 L06 的含量（3.28%），远低于父本 12095B 的含量（6.71%）。

2.4 低谷蛋白新品系农艺性状调查

对低谷蛋白新品系TL0659 的农艺性状进行调查。 在贵州省毕节市， 全生育期为 165.2 d， 株高108.2 cm， 株叶型好， 茎秆较坚韧， 叶色浓绿， 剑叶直立， 叶鞘、 叶缘绿色； 分蘖力中等， 亩有效穗17.5 万穗；半直立穗，穗型较大，穗粒数为168.2 粒，结实率92.2%，千粒重26.5 g。 粒型阔卵形，颖尖无色、 无芒、 后期转色好。 2019 年品比试验折合亩产526.3 kg，2020 年品比试验折合亩产 542.7 kg， 丰产性好，应用前景广阔。

3 讨论

日本选育出了第一个低谷蛋白水稻品种LGC-1，其可溶性蛋白含量低于4%，将该稻米用于肾脏病患者的临床试验。结果表明，以LGC-1 为主食的患者蛋白质摄入量和血清肌酸酐含量明显降低 （与食用低蛋白代用品效果相同），患者病情得到明显改善。 因此，可溶性蛋白低于4%的稻米被认为是对肾病患者（尤其以大米为主食者） 非常有效的食疗辅助品，培育低谷蛋白功能性水稻品种不仅给肾脏病人带来了福音，也给予了育种者良好的契机。 万建民等[2]选育出了中国第一个低谷蛋白品种W3660，此后，在中国水稻育种界掀起了低谷蛋白育种潮， 筛选低谷蛋白种质资源或利用已有的低谷蛋白种质进行育种研究。2008 年在江苏，笔者就跟随团队进行低谷蛋白种质筛选和育种实践， 开发出了针对低谷蛋白基因Lgc1的 2 种功能标记[8,12]。 2010 年回到贵州工作，又开展了低谷蛋白育种研究， 以含低谷蛋白基因Lgc1的W3660 为亲本，与贵州多个粳稻品种杂交，但后代普遍表现太差， 选育低谷蛋白品种失败， 或许与W3660 在贵州表现太差相关。

分子标记辅助选择已经成为水稻育种的一个重要辅助手段，基于基因DNA 序列的功能标记，更是能准确、简便、高效地对目标基因进行鉴定，具有不受环境条件影响、提高选择效率的明显优势。 项目组以江苏省农业科学院粮食作物研究所引进低谷蛋白材料L06 为母本，以自育的粳稻保持系12095B 为父本，进行杂交组配，采用田间选择和分子标记辅助选择相结合，高效地选育出了综合性状好、丰产性好的低谷蛋白粳稻新品系， 为贵州低谷蛋白水稻生产和种质创新提供了优良种质材料。