鹿茸及鹿副产品中外源污染物研究进展

王泽帅，陆雨顺，刘松鑫，李珊珊，孙印石※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春130112；2.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春130118）

据李时珍《本草纲目》记载，鹿茸、鹿鞭、鹿胎、鹿血和鹿心等均可入药，具有很高的药用价值和养生保健功能，其中鹿茸味甘，性温，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任和托疮毒的功效[1]。作为传统的名贵中药，鹿茸因其具有丰富的药理作用，已经被广泛使用了2 000多年[2]。随着中医学在世界范围内的崛起与应用以及民众对于健康意识的不断增强，从20世纪末开始，鹿茸及鹿副产品在医疗保健用途上不断扩充，市场需求不断扩大，鹿产品越来越畅销。但目前市售鹿产品品质参差不齐，以次充好现象时有发生，严重影响消费者用药的安全性和有效性。

鹿产品中外源性污染物主要来源有两个，一是鹿生长过程中从所接触的土壤、空气、饲料和水等环境中吸附或积蓄；二是在养殖过程中疾病防治的药物残留以及加工、运输和贮藏过程中造成的二次污染[3]。本文就鹿产品中常见外源污染物来源以及相关研究等进行综述，以期为相关鹿产品开发应用提供理论依据。

1 鹿产品中重金属研究进展

重金属可以通过饲料、饮水、空气及其他接触方式进入动物体内，其中饲料和饮水是主要途径。重金属在动物体内蓄积并经食物链放大随食品进入人体，引起机体的慢性损伤，影响神经系统、新陈代谢和免疫机能[4]。进入人体的重金属要经过较长时间的积累才会显示出毒性，因此早期往往不易被察觉，很难在毒性发作前引起足够的重视，从而更加重了其危害性。

鹿产品中的重金属元素有多种来源，例如铅的来源主要有两种：一种是受污染空气的呼吸吸收；另一种是受污染食物的胃肠吸收，后者大部分是由于饲料作物表面的沉积，而作物从天然含铅的土壤中吸收的铅量很小；在饲养时，鹿也会吃一些土壤，因此土壤中的铅也可能会增加机体的总负担[5]。其次，在鹿茸生长过程中需要调动鹿全身的营养成分向鹿茸角聚集，其中就包括大量微量和常量无机元素[6]，可能会导致鹿茸中重金属元素含量的蓄积。此外，加工、运输以及外界环境的污染也会导致鹿茸中无机元素含量的差异，例如通过对比不同加工方式鹿茸中重金属含量，发现经过煮炸的鹿茸16种无机元素（K、Ca、Na、Mg、P、Cu、Zn、Mn、Fe、Ni、Co、Cr、Pb、Cd、As和Hg）总量高于冻干茸[7]。

2020版《中华人民共和国药典》四部中规定了原子吸收分光光度法和电感耦合等离子体质谱法测定Pb、Cd、As、Hg和Cu 5种金属元素的方法；规定了高效液相色谱-电感耦合等离子质谱法测定汞、砷元素形态及价态的方法。我国现阶段没有关于鹿茸及鹿茸制品中重金属含量规定的国家标准，2020版《中华人民共和国药典》规定了39种中药材的重金属的限量标准，其中仅有鹿角胶一项鹿制品规定重金属总量不得超过30 mg/kg，砷盐不得超过2 mg/kg。我国行业标准《鹿茸片》[8]、《地理标志产品西丰鹿茸》[9]、国家标准《食品中污染物限量》[10]和地方标准《地理标志产品吉林梅花鹿鹿茸、鹿鞭、鹿尾、鹿血、鹿胎膏、鹿筋和鹿脱盘》[11]中均对Pb、Cd、As和Hg 4种重金属含量做出规定，但标准并不统一，详细限量见表1。

表1 重金属限量标准Table 1 Limit standards of the heavy metals（mg/kg）

王燕华等[7]比较了不同加工方式及不同部位的梅花鹿鹿茸无机元素的含量差异，其结果认为元素Ca、P、Mg、Fe、Ni和Co的含量呈现蜡片、粉片和纱片依次增加的趋势，元素K、Na、As及重金属元素Cu、Zn、Mn、Cr、Pb、Cd和Hg则较多地分布在蜡片部位。同种加工方式的鹿茸无机元素的含量呈现蜡片、粉片和纱片依次升高的趋势，且粉片、纱片部位明显高于蜡片部位。商云帅等[12]对鹿茸和鹿肉中5种重金属含量进行了检测，应用原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法和全自动汞分析仪测定Pb、Cd、As、Hg和Cu的含量，所测样品中5种重金属含量均远低于《NY/T1162-2006鹿茸片》规定限量值。孙伟丽等[13]利用微波消解前处理及电感耦合等离子质谱仪比较了梅花鹿三杈茸不同加工方式不同区段20种矿物质元素含量的差异，结果发现重金属元素Pb、Cd、As和Hg在鹿茸中含量很低，符合《食品中污染物限量》规定。赵海平等[14]从吉林省和山东省7个梅花鹿养殖区收集了42份鹿茸样品，冻干处理保存，采用微波消解及电感耦合等离子体质谱法测定样品中18种矿物质元素含量，结果表明样品中Pb、Cd、As和Hg均未超出《中华人民共和国药典》（2015版）对中药材重金属质量分数的规定，符合我国中药材重金属的安全性要求。Grazyna等[15]采集了赤鹿的肌肉、肾脏和肝脏样本，用电感耦合等离子质谱法检测了包括铅、镉在内的17种微量元素，结果发现整个肾脏中Ba、Cd、Cr、Ga、Pb、Se、Sr和Ti的含量高于同一动物的肝脏或肌肉组织，其中新鲜肌肉组织、肝脏和整个肾脏中Cd的中位数分别为0.07、0.18和3.3 mg/kg，造成这种结果可能是因为铅、镉可以通过多种途径进入动物体内，且镉会在动物肾脏中积累，含量随着年龄的增加而增加。但考虑到允许摄入量的不确定性以及大多数人对鹿肉消费较少，他认为这两种重金属的风险不一定很大。李倩等[16]用微波消解前处理及电感耦合等离子质谱仪对梅花鹿鹿骨、鹿角和鹿髓中的无机元素进行了分析，结果发现按《中华人民共和国药典》（2015版）的限量要求，鹿骨、鹿髓中的Hg、As、Cd及鹿角中的Cu、Hg、As和Cd的含量超标。鹿茸中重金属元素含量普遍较低，因此电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）和电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）是目前常用的重金属元素检测方法，较原子吸收光谱（AAS）法而言，这两种方法的检出限低、灵敏度高且可同时分析多种元素。目前国内有关鹿产品中重金属的文章大多关注于含量检测，对于梅花鹿、马鹿鹿产品产业链中土壤、饲料及鹿茸中重金属来源以及重金属在鹿茸中分布的研究依然较少。

2 鹿产品中抗生素研究进展

抗生素是指来源于微生物代谢产物及其衍生物，在低浓度下对其他微生物具有抑制或杀灭作用的药物[17]。其中磺胺类药物使用普遍，具有抗菌谱广、吸收较迅速、较为稳定及不易变质等优点[18]，在我国畜牧业中常用于预防和治疗细菌感染性疾病。合理使用抗生素可以对动物疾病进行预防和治疗，也可以促进畜禽生长，有效降低养殖成本[19]。例如鹿场中常见使用青霉素和硫酸卡那霉素对鹿的肺炎病进行治疗以及使用肌肉注射恩诺沙星治疗鹿的下痢疾病[20]。通常情况下动物源性食品中抗生素残留并不会对人体产生致命性的影响，但人体内抗生素积累到一定含量之后则会导致肠胃功能紊乱、影响脏器功能的不良反应[21,22]。目前对人体危害最严重的的抗生素为青霉素，除此之外还有链霉素和氯霉素。抗生素不仅会在人体内逐渐积累，导致体内微生物群失调、肝肾功能异常等问题，还会造成人体对抗生素药物耐药性的增强，甚至危害生态环境的安全[23]。目前我国对于抗生素在养殖业的相关政策尚未完善，且我国对于鹿制品中抗生素残留研究较少，抗生素残留的问题已经引起人们的重视。

国家标准、行业标准2020版《中华人民共和国药典》对动物源产品中的抗生素检测方法进行了规定，见表2。国内外检测抗生素常用技术包括高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法、免疫分析法和微生物检测法等。

表2 抗生素的检测方法Table 2 Methods for the dection of antibiotics

王丽艳[30]对吉林、河南及其他一些省市地区临床分离的鹿源致病性大肠杆菌进行了耐药性的初步调查，选取了10株对-内酰胺类抗生素具有不同耐药强度的菌株进行了6种-内酰胺类抗生素最小抑菌浓度的测定，结果发现10株菌对氨苄西林和阿莫西林的耐药性很高，因此在治疗前对病原进行耐药性检测十分必要。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged和Safe）是近年来国际上最新发展起来的一种快速检测的样品前处理技术，具有快速、准确、高效的特点。黄胜广等[31]采用QuECHERS前处理技术，以乙腈-乙酸乙酯为提取剂，150 mg乙二胺基-N-丙基、100 mg C18与70 mg中性氧化铝为净化剂，建立了一种UPLCMS/MS同时测定梅花鹿鹿茸中36种兽药残留的方法，其中包括头孢噻呋、头孢拉定等5种头孢类抗生素兽药，其方法操作简单，净化效果显著。Walt等[32]对白尾鹿肌肉注射氟苯尼考、头孢噻呋、图拉霉素、土霉素和莫西替丁5种抗生素，并在注射后11 d、21 d和31 d检测肌肉和肝脏样本中药物残留含量；在3个时间点的肌肉和肝脏样品中仅检测出图拉霉素平均含量为0.69 mg/kg，在所有样品中均未检测出氟苯尼考、头孢噻呋或莫西替丁，在11 d的肝脏样品中检测出了土霉素，含量为0.05 mg/kg；组织中残留的抗生素含量均低于美国食品药品管理局标准。Anderson等[33]利用加热电喷雾电离（HESI）和大气压化学电离（APCI）优化了灵敏度，采用液相色谱-串联质谱法建立了白尾鹿组织中氟苯尼考残留的确认和检测方法，肝脏和肌肉中检测结果为0.4~0.6g/g和0.02~0.05g/g，低于美国食品药品管理局标准。

国际食品法典委员会和欧盟等规定食品中的磺胺总量不能超过100g/kg，我国农业农村部标准规定磺胺类药物的总残留量最高为100g/kg[34]。我国对动物源食品中磺胺类药物残留的检测方法规定见表3。

表3 磺胺类药物检测方法Table 3 Testing methods of sulfa drugs

黄胜广等[42,43]采用分散固相萃取的前处理技术、UPLC-MS/MS法同时测定梅花鹿鹿茸及鹿鞭中的18种磺胺。样品以乙腈为提取剂，以PSA（乙二胺基-N-丙基）、C18（十八烷基硅烷）与中性氧化铝为净化剂，鹿茸及鹿鞭中检出的磺胺类药物残留均小于0.5g/kg，并未超出食品标准中磺胺限量。此操作简便，净化效果显著，灵敏度高，准确性好，检出限低。Jiang等[44]开发了一种新的双比色酶联免疫吸附法（DC-ELISA），可同时检测牛奶中22种磺胺类药物。氟喹诺酮类和磺胺类药物的检出限分别为2.4 ng/mL和5.8 ng/mL，其所开发的免疫分析方法适用于低分子量污染物的高通量筛选。该方法将两种不同的酶（碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶）同时用于单次免疫测定的每个孔中，用于检测多种低分子量化合物。HPLC法灵敏度低，抗干扰能力差；GC-MS法样品需经衍生化处理，操作复杂；酶联免疫分析法重复性较低，稳定性较差；UPLC-MS法具有选择性强、灵敏度高和检测限低等优点，是目前最常采用的磺胺类药物残留的检测方法。

3 鹿产品中镇静剂类药物研究进展

鹿茸的采收是在鹿茸快速生长期，这一时期的鹿茸具有丰富的血管、神经和软骨组织[45]，并且公鹿体型庞大，具有一定的攻击性，若直接保定锯茸，会给鹿带来较大的痛苦和应激反应，容易发生意外事故。出于动物福利和人员安全考虑，养殖户会在采茸前对鹿进行充分地麻醉，将鹿麻倒后再锯茸。鹿用麻醉剂的主要成分为盐酸赛拉嗪（Xylazine，盐酸二甲苯胺噻嗪，商品名隆朋），是第一个广泛用于动物的-2肾上腺素能受体激动剂，不同剂量使动物产生镇静、镇痛、肌松和麻醉等效应[46]。从药物残留问题来看，采茸后鹿茸中的药物残留不仅可能会影响到鹿茸的药理作用，还对人类健康具有潜在的危害[47]。长期食用含有赛拉嗪残留的动物源食品可能会表现出恶心、呕吐、头晕、无力、四肢及口舌麻木等症状。赛拉嗪在肝微粒体中的主要代谢产物是由CYP3A介导的，在体内吸收、代谢和分解的速度很快，半衰期为4.1 min，其主要代谢产物为2,6-二甲基苯胺（2,6-Dimethylaniline,DMA）[48]。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构将其列于2B类致癌物清单中。

目前动物福利已经是畜牧业发展中不可缺少的重要内容，鹿的福利问题影响鹿茸及鹿副产品在市场中的销售，决定着养殖者的利润。在澳大利亚、新西兰等地的养鹿业中普遍使用利多卡因进行局部麻醉[49]，但是该法需要一定的设备，成本较全身麻醉高。目前国内通常都使用全身麻醉的方法，即通过吹针在鹿的臀部注射麻醉药进行麻醉，一般用药10~15 min后，鹿处于全身麻醉状态，此时可进行锯茸。锯茸结束后采用结扎止血法，止血后可按照麻醉药用量的1:1肌肉注射麻醉拮抗药如苏醒灵或鹿醒宝等消除麻醉作用[50]。此种方法进行麻醉的设备简单、操作方便、成本低廉，但是从行为学角度观察表明，其对鹿产生了极大地伤害，不仅从伦理和福利上欠妥，而且还有可能造成鹿茸中的药物残留。

国家标准（GB31660.6-2019）[51]规定液相色谱-串联质谱法检测动物性食品中5种2-受体激动剂残留，我国对于盐酸赛拉嗪的残留量限量标准不多，仅在《农业部235号公告动物性食品中兽药最高残留限量》[34]中对赛拉嗪等镇静剂做出规定，见表4。

表4 动物性食品中镇静剂类药物残留限量Table 4 Residue limits for tranquilizers in animal feeding stuffs

高明辉等[52]分别于马鹿割茸前后从颈静脉采取血样，用于检测赛拉嗪对机体抵抗力的影响，结果发现割茸后1 h血清杀菌活性降低，割茸后3 h又恢复到原来水平；IgM含量在24 h略有下降，48 h后恢复到正常水平，即马鹿割茸时注射赛拉嗪不引起血清中杀菌活性、溶菌酶活性以及IgG和IgM的实质性变化。尹柏双等[53]通过给梅花鹿注射复合麻醉剂，监测了梅花鹿麻醉后血压及检测静脉血中（PRA）肾素、醛固酮（ALD）、血管紧张素（AⅡ）、心钠素（ANP）和降钙素基因相关肽（CGRP）含量，研究发现血浆中ANP、AⅡ、ALD和PRA含量呈先降低后升高的趋势，于麻醉剂注射后75 min时达到最低点；CGRP含量先升高后降低，于麻醉剂注射后75 min时达到最高点，各项指标在麻醉剂注射后120 min恢复到正常水平。Kovacova等[54]应用细胞体外模型检查了氯胺酮、甲苯噻嗪和氯胺酮甲苯噻嗪混合物对鹿的细胞毒性，与从心脏和肾脏培养的细胞相比，肝源性细胞对氯胺酮和甲苯噻嗪作为单一药物的细胞毒作用表现出更高的敏感性，氯胺酮甲苯噻嗪混合物对肾源性细胞的细胞毒性显著提高。

黄胜广等[55]采用分散固相萃取的前处理技术，建立了一种UPLC-MS/MS法同时测定梅花鹿鹿茸中赛拉嗪和代谢产物2,6-二甲基苯胺的方法，结果表明在70只鹿茸中有4只检出赛拉嗪，其中1只未达到定量限；各鹿茸样品均未检出赛拉嗪代谢产物2,6-二甲基苯胺，原因可能为赛拉嗪代谢物是苯胺衍生物，是非常易挥发的物质，且代谢物的浓度太小，保留时间短，代谢物可能与溶剂一起洗脱。Dickson等[56]检测了新西兰马鹿茸中的赛拉嗪残留量，采用高效液相色谱法半定量确认提取物中赛拉嗪的存在，定量结果用气相色谱法测定，测得鹿茸中赛拉嗪含量在70~220 ng/g之间。镇静剂类药物残留检测方法主要集中于高效液相色谱-串联质谱法，该方法分析范围广、分离能力强且灵敏度高，相较其他检测方法应用更加普遍。目前国内外对于鹿麻醉剂代谢途径、代谢产物及鹿产品中麻醉剂残留研究较少。

4 鹿产品中激素类药物研究进展

鹿茸是目前发现的唯一可以完全再生的哺乳动物附属器官[57]，具有年周期性再生的特性，角柄和初角茸的形成及鹿茸的再生与雄激素浓度变化密切相关。鹿茸角在整个生长周期内都受体内睾酮含量的严格控制[58]。在实际生产中，当头茬茸采收之后，在锯口处会自然生长出再生茸，但是该再生茸往往不规则、重量低且骨化程度较高，影响再生茸的经济价值。若在头茬茸采收后人为地控制鹿体内睾酮的水平，则可延缓鹿茸的骨化，降低鹿只性欲，既可提高再生茸的产量，又能减少争偶角斗伤亡。给梅花鹿注射增茸素可以促进二茬茸的发育，增加二茬茸的质量，但是经抗雄性激素处理的鹿茸产量及寿命可能会受到影响，且鹿茸可能会涉及到药物残留等问题。增茸素大多为抗雄性激素或孕酮制成的药物缓释剂，常见有醋酸氯地孕酮、康士得和氟他胺等[59]。通常是在头茬茸采收后将激素缓释剂一次性皮下注射于颈背部或角基处。由于增茸素的释放是一个缓释的过程，往往会导致再生茸中增茸素残留，长时间食用含有孕激素的食品可能影响人体的激素平衡，产生恶心、头痛和月经紊乱等问题[60]。

目前对于鹿茸中激素残留的研究较少。我国农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》[34]中规定，醋酸氟孕酮最高残留限量为1g/kg，对醋酸氯地孕酮并未做出明确限定，各激素规定见表5。中华人民共和国农业部第176号公告中《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》[61]收录了醋酸氯地孕酮。此外，我国国家标准（GB/T 21981-2008）规定了液相色谱-质谱/质谱法测定动物源食品中50种激素残留量的方法[62]。

表5 动物性食品中激素类药物残留限量Table 5 Hormone drug residue limits in animal feeding stuffs

激素的检测方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用法等。气相色谱法和液相色谱法的灵敏度较低，特异性差，不适用于痕量兽药残留分析的要求[63]。黄胜广等[64]采用分散固相萃取的前处理技术，建立了一种UPLC-MS/MS法同时测定梅花鹿鹿茸中包括醋酸氯地孕酮在内的5种外源孕激素的检测方法。鹿茸样品以乙腈为提取剂，50 mg PSA与30 mg中性氧化铝为净化剂，结果5种孕激素在0.2~10 ng/mL内线性关系良好，平均加标回收率为80.1%~105.4%，RSD均小于5%。Lu等[65]建立了气相色谱-串联质谱法测定鹿茸中18种性激素的分析方法。鹿茸中的性激素经固相萃取富集和净化，经七氟丁酸酐衍生处理，实现了包括睾酮、孕酮在内的18种性激素的有效分离，并在3份鹿茸样品中检测出了甲羟孕酮，4份样品中检出了乙炔雌二醇，这两种激素都为外源激素。王任晶等[66]应用放射免疫方法测定了31批梅花鹿茸药材及其饮片中睾酮、孕酮和雌二醇3种激素含量，结果显示梅花鹿药材中梅花鹿脱盘中激素含量最高，饮片中蜡片激素含量最高，为梅花鹿药材及其饮片的品质评价提供了依据。由于激素种类繁多，相对分子质量大，检测难度较大。气相色谱法要求分析物有较低的沸点和很好的挥发性，由于激素单体性质的差异常需要对其进行多种衍生处理[67]，虽然气相色谱法也能实现对其定性和确证分析，但需要衍生处理而太耗时，不能满足快速分析的需要。有的激素也不容易通过衍生得到很好的极性和热稳定性，因此激素残留检测的现行标准多采用液相色谱-串联质谱法。

5 食源性病原微生物研究进展

我国对于食品中微生物菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的检验均制定了国家标准[68-73]。《中华人民共和国药典》[21]、国家标准《食品中致病菌限量》[74]及行业标准《鹿茸片》[7]对微生物指标做出规定（见表6）。现阶段国内外常用的食源性致病菌监测技术主要有传统生化鉴定 法、免疫学检测技术、PCR技术、色谱及其联用技术等。

表6 微生物残留限量Table 6 The limits of microbial resibues

班硕等[75]用浓度为2%的醋酸溶液喷涂后，在距离紫外灯53.38 cm的距离用紫外线照射120 s，在此条件下，鹿肉的初始菌落明显降低了97.5%。梅妹等[76]对长春市周边地区的梅花鹿源大肠杆菌进行分离、培养和生化反应鉴定，测定了菌株对15种抗菌药物的敏感性，并且应用PCR方法检测了9种耐药基因。结果表明，菌株对磺胺类和四环素耐药性最严重，而且大多数菌株呈多重耐药性。传统的细菌检测方法，如培养和菌落计数法，可能需要几个小时甚至几天才能得出结果[77]。近年来，食源性致病菌的免疫学检测技术飞速发展。任晓航[78]根据鹿茸及鹿血中布鲁氏菌和结合分歧杆菌的特异性基因序列，设计合成特异性引物和探针，成功分别建立了两种菌株的实时荧光定量PCR检测方法。胶体金法快速诊断方法具有较好的特异性，不需要专门仪器、不需要进行专业培训并且具有简便快速的优点，能达到快速诊疗的目的，但该方法灵敏度较差，容易造成漏诊。基因芯片、基因探针等虽具有灵敏度高、检测时间短等优点，但试剂价格昂贵，需要一些特殊的设备、场地和专门的技术人员，目前只是处于实验室研究阶段。

6 结语与展望

动物类药材是中医临床方剂的重要组成部分，可替代品种少，疗效独特，地位十分重要。随着我国人民健康意识的提高，市场对鹿产品的需求逐渐增加，特别是对于优质梅花鹿茸更是供不应求。鹿茸作为动物药之首，其品质直接关系着临床疗效和用药安全。目前鹿茸药材主要来源于人工养殖，养殖过程中重金属的引入、兽药残留及加工和贮藏过程中食源性病原微生物的污染都有可能影响鹿茸及鹿产品的品质。随着国家“中药标准化”进程的推进，提高与完善动物类药材质量标准，增加指标性及专属性成分含量的检测，提高动物药材、饮片真伪鉴别的准确性、增加针对性的检查项目，如水分、灰分、重金属、微生物和兽药残留等检测，避免增重、掺假使假现象，提高鹿茸及鹿副产品安全性等是鹿产品需要重点解决的问题之一。