建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)的脱除研究

靖 晶，李 军，刘凤军，徐 君，姜红卫，李 青

（苏州市农业科学院/太湖地区农业科学研究所，江苏苏州215000）

0 引言

蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodita)是观赏价值极高的花卉之一，其花型奇特，花色艳丽，花期长，深受人们的喜爱，素有“兰花皇后”的美称。蝴蝶兰在兰花市场上占有相当大的比例，主要用作切花和盆花栽培。现在市场上对蝴蝶兰的需求量正在逐年增加。目前运用组织培养技术对蝴蝶兰进行繁殖是兰花工厂化生产中普遍运用的繁殖方式，这种无性繁殖方法具有保持母本优良形状、缩短繁育周期、利于周年生产的优点，但是因为不经过有性繁殖世代，很容易造成病毒积累，严重影响蝴蝶兰的观赏价值和商业价值。据统计，兰花受到约27种病毒的侵染，最主要的是建兰花叶病毒(CymMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)[1]。这2种病毒的普遍发生与无性繁殖方式有着密切的关系，人工繁殖时造成的机械伤口可导致病毒的广泛传播，因此，与病株直接接触、使用被病株污染过的器具等都有可能传播该病毒[2]。随着国内外兰花品种交流的增加和贸易的迅猛增长，也给病毒病的传播和蔓延提供了更多的机会。研究和建立一种既能保持品种优良特性和较高的繁殖系数，又能脱除培养材料中的病毒病原的有效方法，对于防止病毒的进一步扩散，减少种植者的风险具有重要的现实意义。

White和Limasset等研究表明，病毒浓度呈梯度变化，病毒粒子随植物组织的成熟而增加，旺盛生长的根尖、茎尖很少有病毒分布[3-4]。目前已有的报道有多种脱除病毒的方法，有通过喷洒农药杀死传播媒介昆虫，也有通过转基因手段给植物导入抗性基因等，然而应用最广泛的就是通过组织培养技术对植物进行脱除病毒[5]。现有的通过组织培养技术进行植物脱毒的研究主要包括茎尖分生组织培养脱毒[6]、热处理结合茎尖的脱毒法、化学药剂结合茎尖分生组织的脱毒法[7]、珠心胚培养脱毒法及茎尖微体嫁接脱毒法等[8]，还有近几年报道的超低温脱毒技术[9]。Morel等[10]首次通过茎尖培养成功获得脱毒的大丽花，之后茎尖培养相继用于桃、樱桃、樱花、豆樱、山樱花等植物脱毒。朱根发等[11]对文心兰的脱毒快繁技术进行了研究，利用文心兰的茎尖生长锥诱导出原球茎后，通过症状观察、生物接种、电镜观察和血清学检测方法进行了CMV、TMV、CyMV、ORSV等4种常见兰花病毒病的检测，成功地建兰了3个品种的文心兰脱病毒无性系。姜玲、张明涛等[12]对墨兰圆球茎顶端分生组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒(CyMV)的效果进行了研究，发现原球茎顶端分生组织经过20 mg/L的三氮唑核苷处理，可以获得100%的无病毒苗。王玉英等[13]以兰属花卉虎雪兰组培原球茎为试材，采用玻璃化超低温法对兰花病毒的脱除进行了研究，结果表明,在蔗糖浓度0.5 mol/L预培养4天，然后在蔗糖0.6 mol/L加载液冰上处理50 min，之后转入PVS2溶液冰上玻璃化处理120 min，再液氮冷冻40 min，之后经过水浴解冻和卸载后恢复培养，原球茎成活率可达到65%以上，随机检测不同处理样品的脱毒率可达97%。

目前，针对蝴蝶兰的脱除病毒方面的研究已有少量报道。程晓菲等[14]分别从云南蝴蝶兰病样中分离到隶属于番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的病毒分离物Tospo-Pha。葛云星[15]通过诱导茎尖形成原球茎的方式来进行蝴蝶兰脱毒的研究，发现接种成活率与茎尖大小呈正比关系，茎尖小于0.2 mm时，成活率不超过25%。需要说明的是，该种方法可能存在原有性状的变异。郑荔丹等[16]报道称，蝴蝶兰原球茎在33～37℃温度下热处理4周，然后采用带2～3个叶原基的茎尖作为外植体，脱毒率比对照（未经热处理，只培养茎尖）提高23%～26%。现有的关于蝴蝶兰脱毒的研究大多不成体系，研究不够深入，脱毒方法简单或者表述不清，方法的可重复性不强；另外在脱毒病毒前后，并没有分别进行病毒的检测工作，这样就无法确定通过相应的实验操作后，最终病毒是否完全脱除干净，或者脱除到什么程度。本实验在前人研究的基础上，通过组织培养的方式，将茎尖顶端分生组织培养与化学处理方法相结合，这种方法目前在蝴蝶兰脱毒处理上尚未见报道。另外，在本实验前后运用了酶联免疫试剂盒的方法进行了病毒检测，旨在比较准确地把握不同脱毒方法脱除病毒的效果和程度。

1 材料与方法

1.1 植物材料的准备及病毒检测

从北京市蝴蝶兰生产温室采集叶片上带有不规则褪绿斑纹的蝴蝶兰植株，以健康的蝴蝶兰作对照，运用Compound direct ELISA法分别进行2种病毒CymMV和ORSV的检测。2种病毒的ELISA试剂盒由美国Agdia公司提供，切取植株叶片在样品提取缓冲液中研磨后静置，提取上层清夜用于病毒检测。经过包被抗体，孵育，洗板，点样及孵育，洗板，加酶标记物稀释液及孵育，洗板，加PNP底物溶液及孵育的过程后，可以用肉眼直接观察检测结果。每个样品分成2份分别进行2种病毒（CymMV和ORSV）的试剂盒检测，比较阳性孔和阴性孔的颜色对照。2种病毒的显色反应均是显黄色的样品为阳性含病毒的样品，显无色的样品为阴性不含病毒或者病毒含量较低的样品。将阳性含病毒的植株进行标记，作为脱病毒实验的植物材料。

1.2 外植体消毒及培养条件

切取已检测出含CymMV和ORSV病毒的蝴蝶兰植株的花梗为外植体材料，将含有腋芽的花梗节段先用75%酒精棉球擦拭一遍尤其是腋芽部位，之后用洗涤灵清洗10 min再用自来水冲洗30 min，放入75%酒精灭菌30 s，再在0.1%升汞中处理12 min后，在无菌水中清洗4～5次，用解剖刀分别切去消毒后花梗两端各1 cm左右之后，接种到诱导腋芽的培养基中。培养室温度为(25±3)℃，光照强度15～20 µmol/(m2·s)，光照时间12 h/d，相对湿度70%～80%。

1.3 腋芽诱导及增殖

在MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 mg/L培养基(pH 5.8)上诱导花梗腋芽。经过大约2个月的诱导培养后，外植体逐渐分化出2 cm左右的丛生芽，此时将其切离花梗并转接到增殖培养基上进行继代壮苗，增殖培养基为MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L(pH 5.8)。大约2个月后，当丛生芽在增殖培养基中生长至3～4 cm左右时，可以用于脱毒培养。

1.4 脱毒处理及蝴蝶兰植株再生

取增殖培养基中经过继代后的组培苗，将外围叶片去掉，保留中心生长点，切取大小为1～2、2～3、3～4、4～5、5～6 mm的茎尖顶端分生组织，然后接种到培养基MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中进行培养诱导形成新芽。每长度处理50个茎尖顶端分生组织小块，重复3次，比较不同茎尖长度的成活率和脱毒率。以上述实验结果作为化学处理切取茎尖长度的依据，切取大小为2～3 mm的茎尖顶端分生组织，分别放入含有0、10、20、30和40 mg/L三氮唑核苷的无菌离心管中浸泡15 min，然后将上述材料分别接种到含相应浓度的三氮唑核苷的培养基MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L(pH 5.8)中培养30天，诱导生成丛生芽，之后再转入不含抗病毒剂的培养基中。每浓度处理50个茎尖顶端分生组织小块，重复3次。继代培养2～3个月后，形成新生的丛生芽。将丛生芽接种到生根培养基1/2MS+6-BA 2.0 mg/+NAA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+0.5%活性炭中进行生根培养，获得再生植株，采集其叶片进行病毒检测。

1.5 脱毒培养后的ELISA检测

按照Compound direct ELISA法，对脱毒处理之后的再生植株，进行2种病毒CymMV和ORSV的检测[3]。剪取待检测的脱毒后蝴蝶兰植株叶片，在样品提取缓冲液中研磨，然后去上层清液用于检测。检测步骤同1.1。需要注意的是每次检测都需要一个阳性质控孔和一个阴性对照孔，只有在阳性质控孔得到阳性结果，阴性对照孔得到阴性结果的时候，实验结果才是可靠的。另外，只要通过检测后，2种病毒的检测显色反应均为阴性，才算是脱除了病毒。检测结果可直接观察，显黄色为阳性反应证明病毒未被脱除，显无色为阴性反应证明病毒已被脱除。

2 结果与分析

2.1 茎尖大小对茎尖成活率的影响

在切取不同长度的茎尖到相同的诱导培养基中进行脱毒培养的过程中，随着茎尖长度的增加，茎尖成活率明显上升（表1）。茎尖长度是1～2 mm时，接种至培养基中，有4/5的茎尖褐化淹没或者透明状，停止生长，仅有1/5成活并且形成再生植株，成活率极低。当茎尖大小是2～3 mm时，成活率迅速增加，为76%，仅有1/4茎尖死亡。茎尖长度为3～4 mm时，成活率稍有增加，为86%。茎尖大小4～5 mm时，92%的茎尖形成再生植株。当茎尖长度为5～6 mm，茎尖成活率达到最高，为100%，茎尖在接种后20天开始膨大生长，逐渐分生出丛生芽，并形成再生植株。对实验数据的方差分析证明，不同茎尖长度之间茎尖的成活率差异均极显著。

表1 茎尖长度对蝴蝶兰茎尖成活率的影响

2.2 茎尖大小对茎尖脱毒效果的影响

在对成活茎尖诱导出的再生植株进行ELISA法检测后，统计检测结果。表2结果显示，在不同长度茎尖的脱毒培养中，与成活率的变化规律相反，随着茎尖长度的增加，茎尖脱毒率迅速下降。茎尖是1～2 mm时，虽然只有1/5的茎尖成活，但是成活的茎尖形成的再生植株，均未检测到CymMV和ORSV病毒病原。茎尖长度是2～3 mm时，在成活率76%较高的情况下，脱毒率为68%，仅有1/3成活的再生植株仍能检测到CymMV或ORSV病毒病原，所以综合考虑成活率和脱毒率的2个因素并且结合相关资料，将茎尖2～3 mm作为茎尖结合化学处理脱毒切取的茎尖长度。在茎尖大小为3～4 mm时，再生植株脱毒率较低，为54%；当茎尖大小为4～5 mm和5～6 mm时，未检测出病毒病原的再生植株极少，仅为26%和12%。对实验数据的方差分析结果显示，在P=0.05和P=0.01时，各茎尖大小之间脱毒率的差异均极显著。

表2 茎尖大小对蝴蝶兰CymMV和ORSV脱毒效果的影响

2.3 化学处理对茎尖成活率的影响

在含有相应浓度0、10、20、30、40 mg/L三氮唑核苷的诱导培养基上，随着三氮唑核苷浓度的增加，茎尖的成活率明显降低（表3）。在0 mg/L三氮唑核苷的培养基中，即未经化学处理的茎尖，前4周开始变化不大，当继续培养时，茎尖开始萌动生长，成活率为75%，由于茎尖太小(2～3 mm)，25%的茎尖褐化死亡。在10 mg/L三氮唑核苷的培养基中，约有70%的茎尖成活并分生出丛生芽。经20 mg/L三氮唑核苷处理后的茎尖约1/3出现褐变，生长处于停滞状态，另外的2/3茎尖恢复生长。在30 mg/L三氮唑核苷的培养基中处理的茎尖，38%褐化死亡，另外的62%茎尖在转入新的诱导培养基后，需要近2周的缓解过程，生活力才逐渐恢复，随后茎尖细胞不断分裂和生长形成丛生芽。隔30天继代1次，继代2次后，丛生芽生长至2 cm左右时，切分这些芽至增殖培养基中继续培养2～3个月，便形成再生植株。完成脱毒和植株再生程序需要5～6个月。在40 mg/L三氮唑核苷的培养基中，茎尖几乎全部出现严重的透明和褐变现象，细胞生活力很难恢复，未获得再生植株。对实验数据进行差异显著性测验发现，0、10、30、40 mg/L三氮唑核苷处理的茎尖成活率两两之间均差异显著，而20 mg/L与10 mg/L三氮唑核苷处理，以及20 mg/L与30 mg/L三氮唑核苷处理的茎尖成活率之间差异不显著(P=0.05)。

表3 三氮唑核苷处理对蝴蝶兰茎尖成活率的影响

观察发现，经过脱毒培养形成的再生植株，试管苗上并无典型的CymMV和ORSV症状。将经过继代培养形成的丛生芽，接种到生根培养基中，30～40天后每株可长出3～4条健壮的根，根长3 cm左右。

2.4 化学处理对茎尖脱毒效果的影响

实验表明，在用三氮唑核苷处理的茎尖脱毒培养中，随着三氮唑核苷浓度的升高，茎尖2种病毒（CymMV和ORSV）的脱毒率呈明显增长趋势（表4）。在未用三氮唑核苷处理中，即直接切取2～3 mm的茎尖顶端生长锥，通过组织培养诱导形成的再生植株，有32%仍带有CymMV或ORSV病原。在10 mg/L三氮唑核苷的培养基中，由于三氮唑核苷对病毒复制的抑制作用，比较0 mg/L三氮唑核苷的处理，脱毒率明显升高，达到80%，即仍有20%未脱除病毒病原。经20 mg/L三氮唑核苷处理后的茎尖有较好的脱毒效果，脱毒率约为91%，仅有9%仍带有病毒病原。而经30 mg/L三氮唑核苷处理后诱导的再生植株，其叶片经过ELISA检测后，未检测出CymMV和ORSV病原，结果均为阴性，脱毒效果最为理想。经4个处理样本脱毒率百分数的差异显著性测验，添加三氮唑核苷的处理与未添加三氮唑核苷的处理间差异极显著，同时4个处理两两之间的差异均极显著。

表4 三氮唑核苷处理对蝴蝶兰CymMV和ORSV脱毒效果的影响

3 结论与讨论

从理论上讲，茎尖分生组织不带病毒或带毒浓度很低，使茎尖培养脱毒成为可能。本研究没有直接取已检测出含有CymMV和ORSV病毒的植株茎尖顶端分生组织，而是取其花梗进行组织培养诱导成组培苗，并经过增殖继代，然后取组培苗的茎尖分生组织进行脱毒培养，这样一方面降低了病毒含量，本身的组织培养过程就是一个脱毒的过程；另一方面丰富了脱毒材料的来源，并且没有直接破坏母株，这是本研究的一个可取之处。本研究结果证明，茎尖长度在1～2 mm时，所取的茎尖分生组织太小，虽然脱毒率很高，但是成活率太低，茎尖很容易褐化死亡，再生植株困难。所以在化学处理结合茎尖脱毒中，所取茎尖大小为2～3 mm，这样减少了植株再生的难度，成活率较高。但是直接培养获得的脱毒率只有68%，加入病毒唑后，脱毒率平均升高22.3%，由此可见，单纯使用茎尖分生组织培养，不能达到理想的脱毒目的。

Lim等[18]研究指出，三氮唑核苷进入被病毒感染的细胞后迅速磷酸化，其产物作为病毒合成酶的竞争性抑制剂，阻止病毒RNA和蛋白合成，抑制病毒的复制与传播。本研究发现，在培养基中加入病毒抑制剂（三氮唑核苷）可以起到一定的抗CymMV和ORSV病毒的作用。但是通过ELISA酶联免疫的检测方法以肉眼观察的方式来进行显色反应的判断，操作简单方便，但是存在较大的误差，不同视觉状态和心理状态的实验者可能会得出不同的观察结果。今后，通过分子生物学的手段进行病毒检测将会是以后进行脱毒研究的重要手段。另外，三氮唑核苷浓度过高时，容易造成植物细胞严重的伤害，产生透明状和褐变现象，甚至导致生命力无法恢复。Klein等[19]在马铃薯上的研究有类似的表现。茎尖的成活率和脱毒率受茎尖大小、三氮唑核苷的浓度和处理时间等因素的直接影响。

本研究主要采取的是切取茎尖顶端分生组织进行组织培养的方式脱毒，该方法的脱毒率直接受剥离茎尖大小的限制，剥离茎尖越小脱毒率越高，但是成活及再生率却越低[20]。因此，在解剖镜下剥取微茎尖属于一个很难的技术挑战，操作失败率高，很容易导致茎尖死亡和褐化。除热处理结合茎尖培养、化学处理结合茎尖培养等方法，近几年开始报道的茎尖超低温脱毒方法是今后的主要研究方向。该技术已成功地应用于脱除甘薯类、柑橘、葡萄、香蕉、李、冬凌草、树莓和大蒜等植物体内的病毒细菌等[21-26]。该技术不仅脱毒效果好，而且对茎尖大小的要求不高，可以克服茎尖培养脱毒的技术难题[27]。在今后的研究中，将以带毒蝴蝶兰茎尖为材料，通过超低温保存法，建立适应蝴蝶兰的完整的超低温脱毒体系，以期为蝴蝶兰的无毒苗生产提供技术支持。