车前子内生细菌的分离、鉴定及生防作用研究

杨雪梅，苟攀宁，张云翔，陆雪兰，贺艳婷，田小卫

车前子内生细菌的分离、鉴定及生防作用研究

杨雪梅，苟攀宁，张云翔，陆雪兰，贺艳婷，田小卫通信作者

（天津农学院 园艺园林学院，天津 300392）

近年来，植物病虫害的生物防治受到人们广泛关注。为了丰富防治植物病害的拮抗微生物资源，本研究选用中草药——车前子为试验材料，对其内生拮抗细菌进行分离，以苹果腐烂病菌（）、番茄早疫病菌（）、小麦赤霉病菌（）、黄瓜白粉病菌（）和草莓灰霉病菌（）为供试病菌，测定其抑菌活性。结果表明，从车前子的不同器官(根、茎、叶、花序)中共分离出20株内生细菌，有5株内生细菌对供试病原菌表现出一定程度的抑制作用，其中R-6菌株的抑菌活性最强，其对草莓灰霉病和黄瓜白粉病的保护和治疗作用分别达到56.9%、50.5% 和49.0%、37.3%。应用形态学、生理生化特性及分子生物学技术对R-6进行了鉴定，初步鉴定R-6菌株为贝莱斯芽孢杆菌（）。

车前子；内生细菌；筛选；鉴定；生防作用

随着我国保护地栽培面积不断增加，植物病害的发生呈逐年加重的趋势，严重影响了农作物生产和农产品质量安全。由于化学农药成本低、见效快、使用方便，目前依旧是植物病害防治的主要途径，但是由于过度使用化学农药，导致了农药残留、环境污染、病原菌抗药性等一系列问题。许多发达国家相继开始了生物农药、绿色农药的研究和开发，我国也提出了以生物防治为主导的绿色防控理念，推动农业由增产导向转向提质导向，大力发展绿色优质农产品生产，因此植物病害生物防治的研究越来越受到人们重视。

植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或者全部阶段生活在健康植物的各种器官和组织内部,宿主植物在短期内不会由于这些菌类的存在而表现出外在的症状，包括内生细菌、内生真菌及内生放线菌等[1]。1992年KLOEPPER等提出了植物内生菌的概念[2]。1993年STIERLE等[3]从短叶红豆杉（）的树皮中分离到一株内生真菌（），能产生抗肿瘤化合物紫杉醇，引起了巨大轰动，自此便打开了植物内生菌资源库研究的大门。目前研究表明，植物内生菌普遍存在于植物体内，与寄主植物在长期进化过程中形成了和谐关系，具有抗病虫害、促生、内生固氮、杀线虫等作用[4]。例如从花生中分离的内生细菌LDO2对植物具有促生和抑制病菌的作用[5]；从蕨类植物问荆中分离的内生细菌对微生物金黃葡萄球菌和大肠杆菌具有强烈的抑菌活性[6]；棉花内生细菌在温室条件下对美洲棉铃虫具有较好的防治效果[7]。

车前子（）是车前科车前属的一种多年生草本植物，耐寒，喜温暖湿润环境。作为一味常用的中草药材，车前子具有利尿、渗湿止泻、清热化痰和清肝明目等药用价值。国内关于车前子内生菌的抗菌物质研究比较少，大多集中在其中药药理方面的研究。因此本试验对车前子内生菌的抑菌活性进行研究，以期筛选出具有抑菌活性的菌株，为寻找对植物病害具有良好生防前景的菌株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

车前子的根、茎、叶、花茎、花序等组织，于2017年7月10日采自天津农学院试验田内。

黄瓜品种：津春4号。草莓品种：市场采购，品种未知。

1.1.2 供试植物病原菌

本试验应用的病原菌分别为苹果腐烂病菌（）、番茄早疫病菌（）、小麦赤霉病菌（）、草莓灰霉病菌（）、黄瓜白粉病菌（）。以上供试菌株均由天津农学院园艺园林学院植物病理学实验室提供。

1.1.3 本试验所用培养基

牛肉膏蛋白胨固体培养基用于内生细菌的分离培养，液体培养基用于内生细菌发酵，PDA培养基用于培养病原真菌和抑菌活性测定。

1.2 试验方法

1.2.1 车前子内生细菌的分离与纯化

车前子内生细菌的分离纯化见参考文献[8]。划线培养，挑取单菌落进行分离纯化。

1.2.2 内生细菌抑菌活性测定

对分离获得的内生细菌，应用对峙法进行初筛，采用生长速率法、活体组织法、盆栽法对其抑菌活性进行验证。

对峙法：在PDA平板中央接种一直径5 mm病原菌菌饼，同时挑取待测细菌菌株点于平板边缘约1.5 cm处，28 ℃黑暗培养5～7 d，测量抑菌带距离，每处理重复3次。并设空白对照。

生长速率法：将R-6发酵液采用0.22 µm滤芯过滤后加入灭菌后的PDA固体培养基中混匀，将15 mL培养基倒入灭菌平皿中。待培养基凝固后，将培养好的病原菌打成直径为5 mm 的菌饼贴于平皿中，使有菌丝面朝下，阴性对照为PDA 固体培养基，25 ℃恒温培养。72 h检查结果，测定菌落直径。

活体组织法：

（1）保护作用：选取新鲜、大小均一的草莓果实（带蒂），清洗晾干，将R-6菌株发酵液喷于草莓表面，放入底部有灭菌湿润滤纸的烧杯中密封，24 h后接种草莓灰霉病菌饼。在接种时使用无菌接种针轻轻刺破草莓表面，将直径为5 mm的草莓灰霉菌饼反接于草莓果实表面的破口处，并置于25 ℃人工气候培养箱保湿培养，5～7 d后测定病斑直径，计算抑菌率。设清水处理为对照。

（2）治疗作用：治疗作用与保护作用的测定方法基本一致，但区别是先接种草莓灰霉病菌饼，24 h后再喷施R-6菌株菌液[8]。

盆栽法：盆栽法和活体组织法的试验方法基本相同。盆栽幼苗为黄瓜三叶期幼苗，制备黄瓜白粉病菌分生孢子悬浮液，浓度为15×10倍显微镜下每个视野30～40个孢子，喷雾接种黄瓜白粉病菌，用发酵液喷洒处理3次，每次处理间隔7 d，最后调查病情指数和计算防效。

1.2.3 计算方法

病情指数、防治效果、抑制率计算公式如下：

1.2.4 内生细菌的初步鉴定

1.2.4.1 形态学观察

在牛肉膏蛋白胨培养基上划线培养，待单菌落长出后，观察菌落形态、大小、颜色、边缘以及隆起程度等。进行革兰氏染色，应用光学显微镜对其形态进行显微观察，参照东秀珠等方法进行鉴定[9]。

1.2.4.2 生理生化特性

生理生化方法参考东秀珠等方法进行[9]。

1.2.4.3 分子生物学鉴定

应用16S rRNA序列对该菌株进行分子鉴定。用灭菌牙签挑取单菌落放入PCR管中，加入10 μl灭菌超纯水，充分震荡混匀，热裂解后作为扩增模板。应用细菌16S rRNA通用引物（27F：5＇- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇，1 492R：5＇- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）进行扩增。PCR扩增反应条件：94.0 ℃ 35 s，51.0 ℃ 40 s，72.0 ℃ 80 s，72.0 ℃ 10 min，35个循环。

取3 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶检测。样品送到华大基因测序，测序结果与NCBI数据库进行比对分析，并利用MEGA 5.0软件建立系统发育树，初步确定菌株类别。

2 结果与分析

2.1 车前子内生细菌的分离

本研究对车前子植物内生细菌进行了分离，经过多次分离、纯化后，共获得20株车前子内生细菌。其中，从根部分离获得7株内生细菌，茎秆3株、叶片3株、花茎1株、花序6株。

2.2 车前子内生细菌抑菌活性测定

2.2.1 内生细菌对病菌的抑制作用

内生细菌对4种病菌的抑制作用如表1所示。20株内生细菌中有5株菌株对苹果腐烂病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌、草莓灰霉病菌均具有一定的抑制作用，其分别为R-6、A-1、A-2、L-2、S-1，在对峙培养中均能出现较为明显的抑菌带。其中R-6菌株的抑菌效果最突出，除了番茄早疫病菌外，对其他3种病原菌的抑菌带宽度均在2 mm以上。

表1 内生细菌对4种病原菌的拮抗作用

注：拮抗带宽度：＋表示0～0.5 mm，＋＋表示0.5～2.0 mm，＋＋＋表示≥2.0 mm

2.2.2 车前子内生细菌发酵液抑菌活性测定

5株内生细菌的发酵液对4种植物病原菌的抑菌活性如表2所示，其中R-6菌株发酵液的抑菌活性最强，对小麦赤霉病菌的抑制率达77.4%（图1），对其他3种病原菌的抑制率均在60.0%以上。其余4株内生细菌的抑菌活性相对较差，其抑菌率均在60.0%以下。

表2 5株车前子内生细菌发酵液的抑菌作用 %

2.2.3 组织活体抑菌活性测定

从图2可以看出，R-6菌株发酵液对草莓灰霉病均有一定的保护作用与治疗作用，其保护作用达56.9%，而治疗作用略低于保护作用，为50.5%，表明在组织活体上菌株R-6对草莓灰霉病也具有较好的防治效果。

2.2.4 盆栽试验

R-6菌株发酵液对黄瓜白粉病的保护作用和治疗作用如表3所示。R-6菌株发酵液对黄瓜白粉病也具有一定的保护和治疗作用，且保护作用优于治疗作用，其保护和治疗作用分别为49.0%和37.3%。

表3 R-6菌株发酵液对黄瓜白粉病的防治效果

2.3 内生细菌R-6菌株的鉴定

2.3.1 菌落形态学观察及生理生化特性

在牛肉膏蛋白胨培养基上，R-6菌株的菌落形状为圆形或椭圆形，颜色为乳白色，凸起，边缘呈褶皱状，在显微镜下观察为杆状，单个或成双或短链状排列。

通过对R-6菌株生理生化指标测定，鉴定结果如表4所示。参考《常见细菌系统鉴定手册》中的形态学特征与生理生化特征分别与菌株R-6进行比对，可以初步确定菌株R-6为芽孢杆菌（）。

表4 菌株R-6生理生化特征

注：“＋”为阳性，“-”为阴性

2.3.2 R-6菌株的分子生物学（16S rRNA）鉴定

应用细菌通用引物，对R-6菌株16S rRNA进行PCR扩增，扩增产物进行测序。经拼接后菌株R-6的16S rRNA长度为1 448 bp，通过NCBI中的BLAST软件进行相似性比较，R-6菌株核苷酸序列和贝莱斯芽孢杆菌（）的相似度为99.85%。采用MEGA5.0软件基于邻接法构建16S rRNA系统发育树，由图3可见，R-6菌株与贝莱斯芽孢杆菌（）同处一支，遗传进化距离最近。综合菌株形态特征、生理生化测试结果与16S rRNA序列分析，初步鉴定R-6菌株为贝莱斯芽孢杆菌。

3 讨论与结论

本研究从药用植物车前子植株中共分离获得20株内生细菌，分别来自其根、茎、叶、花序等不同组织，表明内生细菌在车前子植株各个组织均有分布，其中根部数量最多。目前研究表明，植物内生细菌具有多样性，不同的植物种类、气候条件、地理环境的内生细菌组成都有较大差异，即使同一植物的不同组织、不同生长时期内生细菌也有一定的变化[10]。

通过抑菌活性测定，筛选到一株抑菌活性最高的内生细菌菌株，命名为R-6，经初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（），在离体和活体条件下对供试病菌均有较好的抑制作用。另外在试验过程中观察到，经R-6菌株发酵液处理的黄瓜幼苗株高、叶片大小及叶片浓绿程度明显优于对照，表明R-6菌株发酵液不仅对黄瓜白粉病具有一定的防治作用，还可能对黄瓜生长也具有促进作用，这和花生内生细菌的研究结果一致[5]。文献报道贝莱斯芽孢杆菌能产生对番茄早疫和番茄灰霉病菌具有抑制作用的挥发性物质[11]，本研究发现贝莱斯芽孢杆菌挥发物对番茄早疫病菌也有微弱的抑菌作用，但活性较弱，未在文中列出。

通过形态特征、生理生化特性及分子技术初步鉴定R-6菌株为贝莱斯芽孢杆菌（）。目前，在生产和应用中，芽孢杆菌中研究较多的主要是枯草芽孢杆菌（）、蜡样芽孢杆菌（）、地衣芽孢杆菌（）及解淀粉芽孢杆（）[12]，而对贝莱斯芽孢杆菌（）的研究相对较少。本研究从车前子筛选鉴定的生防菌株R-6，为内生菌应用生物防治提供了优质的菌株资源，但该菌株田间防病效果及防病机理等尚待进一步研究。

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Isolation, identification and biocontrol effect of endophytic bacteria in medicinal plant

Yang Xuemei, Gou Panning, Zhang Yunxiang, Lu Xuelan, He Yanting, Tian XiaoweiCorresponding Author

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In recent years, biocontrol of plant disease has been widely concerned in the world.In order to enrich the resources of antagonistic microorganisms against plant diseases, the Chinese herbal medicinewas used as experimental material to isolate the endophytic antagonistic bacteria, with,,，andused in this study.20 strains of endophytic bacteria were tested by confrontation method.The results showed that 5 strains of endophytic bacteria showed strong inhibitory effect on the tested pathogens, especially R-6 strains.The protective and therapeutic effects of fermentation products of R-6 on strawberry gray mold and cucumber powdery mildew were 56.9%, 50.5% and 49.0%, 37.3%, respectively.According to its morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence, the R-6 strain may belong to.

; endophytic bacteria; isolation; identification; biocontrol effect

1008-5394（2021）03-0037-05

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.008

P641.131；S152.72

A

2020-06-28

天津市大学生创新训练计划项目（201810061040）

杨雪梅（1997—），女，学士，专业：植物保护。E-mail：631619477@qq.com。

田小卫（1976—），男，副教授，博士，主要从事农药学教学及研究工作。E-mail：tianxiaowei@tjau.edu.cn。

责任编辑：杨霞