犬源伪中间型葡萄球菌的分离鉴定及药敏特性

丁巧玲，刘舒月，孟泽，李建军

犬源伪中间型葡萄球菌的分离鉴定及药敏特性

丁巧玲，刘舒月，孟泽，李建军通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392）

天津某宠物医院接诊的一例患脓皮病的11岁金毛犬，采集其眼部、鼻部和皮肤分泌物，进行细菌分离培养。分离菌株TJ-1经培养特性、染色镜检、生化试验、血浆凝固酶试验、药敏试验及16S rDNA 序列分析，结果表明，TJ-1能分解果糖、乳糖、蕈糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖等，甘露醇和硝酸盐还原反应等为阴性，血浆凝固酶试验阳性；进一步采用PCR方法扩增16S rDNA序列，测序获得长度约为1 500 bp，构建系统进化树分析显示分离菌与聚为一支，最终确定TJ-1菌株为伪中间型葡萄球菌（）。药敏试验的结果显示，TJ-1菌株对苯唑西林、头孢他啶、头孢哌酮、头孢氨苄、多西环素、头孢唑啉、米诺环素、头孢呋辛等药物敏感，对新霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素、青霉素以及氨苄西林等耐药。

犬；伪中间型葡萄球菌；分离鉴定；药敏试验

伪中间型葡萄球菌（）为犬脓皮病的主要致病菌[1]。该菌能引起犬、猫、貂、山羊等多种动物感染发病，临床主要表现为脓皮病、外耳道炎、伤口感染、尿路感染等[2-4]。在发病初期，及时治疗可以控制病情发展。在发病的中后期，可能会引起其他的并发症，对临床治疗带来困难。有研究报道动物源伪中间型葡萄球菌可以感染人[5]，表明伪中间型葡萄球菌对公共健康有一定威胁。本文中患脓皮病的病犬皮肤表面可见多部位大面积脱毛、红疹、脓包，并伴有呼吸道感染，在其眼部和鼻部出现脓汁样分泌物。取样后对病原菌分离鉴定，同时进行药敏试验，为临床犬伪中间型葡萄球菌病的诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

患病犬为天津某宠物医院接诊的一例11岁龄患脓皮症的雌性金毛寻回犬（Lucky）。2×PCR MixPCR预混体系、DNA Marker DL2000均购自上海捷瑞生物工程；LB琼脂、药敏纸片、十六种葡萄球菌生化鉴定管均购自杭州微生物试剂有限公司；冻干兔血浆购自上海华康科技开发公司。

1.2 方法

1.2.1 临床检查

主要针对病犬的免疫情况和病史进行问诊，检查病犬的精神状态、体温、呼吸等。

1.2.2 细菌分离培养与染色观察

采取病犬眼部、鼻部、皮肤分泌物在无菌条件下在LB培养基采用划线方式接种细菌，在37 ℃的条件下培育24 h。挑取优势单菌落接种纯化培养，革兰氏染色镜检。

1.2.3 生化特性检查

无菌操作将分离菌株接种于16支不同营养源的葡萄球菌细菌生化管，37 ℃条件下48 h后观察结果。

玻片法：在洁净的玻片中心滴入0.9%生理盐水，挑取少量细菌，与生理盐水混合，制成菌悬液。若十几秒内没有自动凝固现象发生，加入购买的新鲜兔血浆1环，与菌悬液混合，观察分离菌凝固酶现象。

试管法：用生理盐水4倍稀释新鲜兔血浆，吸取0.5 mL于洁净试管中，加入0.5 mL待检的菌悬液，混匀，放于37 ℃恒温水浴锅中，每30 min观察一次，观察24 h，凝固为阳性[6]。

1.2.4 细菌16S rDNA基因的扩增与测序

挑取5～6个分离纯化后的单菌落于PE管底部，采用煮沸裂解法制备细菌基因组DNA模板。PCR扩增体系为DNA模板5.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，上、下游通用引物各1.0 μL，0.5 μL，用ddH2O补至25.0 μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；然后72 ℃延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳20 min，用透射式紫外分析仪对PCR产物进行检测。将PCR产物送往上海生工公司测16S rDNA基因序列，将获得的基因序列在 NCBI 数据库中进行Blast相似性搜索，获取与分离株16S rDNA序列最为相近的序列。采用DNAstar软件进行多序列同源性比对分析，并构建系统发 育树。

1.2.5 药敏试验

采用 K－B 纸片法对分离菌株进行抗生素药物的敏感试验[7]。无菌操作下，将分离菌株均匀涂布于LB平板上，依次贴上药敏纸片，37 ℃培养24 h后，测量抑菌圈直径。细菌对药物的敏感程度与抑菌圈直径的大小成正比，可判断细菌对各种药片的敏感度。

2 结果与分析

2.1 临床结果

犬体重30 kg，体温39.4 ℃，体味大。犬呈腹式呼吸，右颈前大片皮肤湿疹，背部皮肤有脓包，可视粘膜苍白，眼部有脓状分泌物，流黄色鼻涕。

2.2 细菌分离培养与染色观察

将分离纯化的1株细菌命名为TJ-1，该菌株在LB培养基上形成圆形、湿润、不透明、边缘整齐、表面隆起的光滑菌落。涂片染色为革兰氏阳性细菌，多无规则葡萄串样排列（图1）。

2.3 生化试验

生化试验结果显示，蔗糖、乳糖、覃糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、N-乙酰葡胺为阳性反应；甘露醇、木糖醇、硝酸盐还原等为阴性。该菌株的菌体形态和生理生化特性基本符合葡萄球菌的特征（表1）。

表1 菌株TJ-1的生化试验结果

注：“ ＋ ”表示阳性反应，“ - ”表示阴性反应

玻片法结果显示未出现凝固现象。试管法结果显示，血浆样品在4 h内不凝固，在21 h时发生凝固（图2），分离菌株TJ-1凝集酶试验为阳性，且有致病性。

2.4 菌株16S rDNA序列及系统发育分析

以分离菌TJ-1基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增16S rDNA序列，通过琼脂糖凝胶电泳检测大小约为1 500 bp的目的条带（图3）。通过Blast检索系统进行基因序列同源性比对，表明分离菌株TJ-1的16S rDNA基因序列与AJ780976.1模式菌株序列同源性为99%；从进化树上可见分离菌TJ-1与AJ780976.1-亲缘关系最近，与D83369.1处于小分支上，亲缘关系较近，HM484980.1处于较大分支上，关系较远。与FJ389206.1、X66100.1、L37603.1warneri、D83363.1、AB009935.1、L37599.1、D83366.1、AB009933.1、AF004220.1、AB009940.16个参考株，亲缘关系最远（图4）。

2.5 药敏试验

TJ-1菌株对苯唑西林、头孢他啶、头孢哌酮、头孢氨苄、多西环素、头孢唑啉、米诺环素、头孢呋辛等药物敏感，对新霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素、青霉素以及氨苄西林等耐药（表2）。

表2 菌株TJ-1药敏试验结果

3 讨论

伪中间型葡萄球菌是一类重要的动物性病原菌，自2005年国内外相继有从不同动物分离的报道，该病在犬类的脓皮病中最常见[8]。本研究从病犬的背部皮肤脓包、眼部脓性分泌物和脓性鼻涕里分离到1株TJ-1致病菌，通过16S rDNA基因序列分析结合生化特性将TJ-1菌株鉴定为伪中间型葡萄球菌。

药敏试验结果表明，TJ-1菌株对新霉素、红霉素、卡那霉素、四环素、庆大霉素、青霉素以及氨苄西林等耐药，对苯唑西林、头孢他啶、头孢哌酮、头孢氨苄、多西环素、头孢唑啉、米诺环素、头孢呋辛等药物敏感，这与国内外报道的伪中间型葡萄球菌的药敏谱一致[9-12]，且该菌出现多重耐药的情况。通过与冯言言等对脓皮症分离菌的药物敏感情况进行对比[13]，头孢类药物对分离菌敏感性较高，可作为该病治疗的首选药物。

宠物源伪中间型葡萄球菌的报道逐年增多，主要可引起伴侣动物（主要为犬、猫）的皮肤、软组织及泌尿道感染等[8]。并且随着伪中间型葡萄球菌的耐药性不断增加，尤其是耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌的出现和流行，国外已有伪中间型葡萄球菌感染人的报道[14-15]，严重威胁公共健康。

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Isolation, identification and drug resistance of canine

Ding Qiaoling, Liu Shuyue, Meng Ze, Li JianjunCorrespondingAuthor

（Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

An 11-year-old golden-haired dog with pyoderma was admitted to a pet hospital in Tianjin.The secretions of eyes, nose and skin were collected for bacterial isolation and culture.The results of culture characteristics, staining microscopy, biochemical test, plasma coagulase test, drug susceptibility test and 16S rDNA sequence analysis showed that the isolate TJ-1 decomposed fructose, lactose, mushroom sugar, sucrose, mannose, maltose, mannitol and nitrate reduction were negative, while plasma coagulase test was positive.The 16S rDNA sequence was amplified by PCR and sequenced.The phylogenetic tree analysis showed that the isolate was clustered with Staphylococcus pseudintermedius and TJ-1 strain was identified as S.pseudintermedius.Drug susceptibility test showed that the bacteria were susceptible to oxacillin, ceftazidime, cefoperazone, cefalexin, doxycycline, cefazolin, minocycline, cefradine, cefuroxime and amikacin, but resistant to erythromycin, penicillin, ampicillin and carboxybenicillin.

dog;; isolation and identification; antibiotics sensitivity test

1008-5394（2021）03-0042-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.009

S852.61

A

2020-04-05

丁巧玲（1973—），女，副教授，博士，研究方向为兽医免疫学与动物疾病学。E-mail：qiaolingding@126.com。

李建军（1969—），男，副教授，博士，研究方向为兽医外科学与小动物疾病学。E-mail：jianjunli2003@163.com。

责任编辑：张爱婷