张小杰,周天旺,王春明,郭 成
(1甘肃农业大学植物保护学院,兰州730070;2甘肃省农业科学院植物保护研究所,兰州730070)
近年来,化学农药和化肥的长期大量使用,使得病原菌抗药性迅速增强,防效降低[1],同时对土壤、水质乃至生态环境造成了非常严重的负面影响[2],给植物的安全带来巨大隐患。因此,生防菌剂便以其风险低、环境相容性好的优点凸显了出来[3]。木霉属(Trichoderma Pers.)真菌作为一种适应性强、抗菌谱广、拮抗机制多样化的生防菌,在自然界广泛分布和存在[4-5]。目前已有多种木霉菌被用于生物防治,国内外研究拮抗作用较好的木霉菌通常为哈茨木霉,绿色木霉和长枝木霉。其中,利用长枝木霉可防治多种病害,包括土传病害、林木病害及叶部病害等,均在田间取得了良好的防效[6-9]。其对可可豆[6]、黄瓜[9]、牧草[10]、小麦[11]、玉米[12]等多种植物也具有促生作用,通过改善植物的生长状况,提高植物的抗病性。另外,木霉菌培养条件简单,繁殖速度快,符合工业化生产的需要,被公认为可取代化学试剂,是开发生防制剂防治植物病害的有力竞争者[13]。
现行的木霉菌剂以收获分生孢子为主,木霉大规模的发酵生产对其在生物防治中的应用具有重要的现实意义。获得木霉菌大量培养物的最优发酵条件是该菌大规模应用的前提[14],故发酵方法的选择在一定程度上决定了菌株的生防能力。与传统的液体发酵相比,固体发酵经济实用,目前己成为国内外重要的研发生产工艺[15]。其所获得的孢子浓度高、质量好,产生的孢子对干旱等不利条件的抗性和稳定性更强[16],且发酵设备简单易操作,发酵原料来源丰富、成本低廉。发酵产品可直接制成菌剂,易保存和运输,贮存期长[17],一方面可作为生物肥料,直接播撒于田间,方便农户使用[15],另一方面还可以制成高效的液体剂型的生物农药,达到液体发酵液的效果[18-19]。
目前在生产中使用的木霉商品化制剂已达50多种,使用的含木霉成分生物制剂达到100多种[20-21]。菌株主要以哈茨木霉菌和少量的绿色木霉菌为主,对长枝木霉的研究相对较少[22]。因此,本研究对分离自甘肃省景泰县马铃薯植株根际土壤的木霉菌株TS-1进行了鉴定,抑菌效果、促生作用及固体发酵条件的初步摸索,旨在为该菌株进一步的扩大培养和有效利用提供科学依据和技术支撑,为西北地区的生物防治提供基础。
菌株TS-1分离自甘肃省白银市景泰县条山镇马铃薯植株根际土壤。供试靶标病原菌6株,分别为茄病镰孢(Fusarium solani)、接骨木镰孢(F.sambucinum)、禾谷镰孢(F.graminearum)、尖孢镰孢(F.oxysporum)、拟轮枝镰孢(F.verticillioides)和灰葡萄孢(Botrytis cinerea),均由甘肃省农业科学院植物保护研究所植物病理研究室提供。
1.2.1 形态学鉴定 将菌株TS-1活化于PDA平板上,在25℃恒温黑暗条件下培养3天后,再分别转接于PSA和SNA平板,设3次重复。根据文献[23]观察菌落形态,测量48 h的菌落生长直径,计算生长速率,并且观察子实体的形态特征,进行形态学分类鉴定。
1.2.2 分子生物学鉴定 真菌DNA的提取,采用上海生工生物工程技术服务有限责任公司试剂盒进行。引物选用 EF-1α[24]:EF1-728F:5′-CATCGAGAAGTTCGA GAAGG-3′和 EF1-986R:5′-TACTTGAAGGAACCC TTACC-3′,由上海生工北京分公司合成。PCR扩增产物送交上海生工北京分公司测序。将测序结果与NCBI基因库中已登录的相关木霉EF-1α基因序列进行BLAST比对,利用DNA Star软件构建菌株TS-1的系统发育树。
以菌株TS-1为拮抗待测菌株,其他6种植物病原真菌为靶标菌,参考文献[25-26],采用对峙培养法进行抑菌效果的测定。
1.4.1 孢子悬浮液的制备 参考文献[10],配置浓度为1×108cfu/mL的孢子悬浮液原液,再依次稀释成1×107、1×106、1×105cfu/mL的孢子悬浮液备用。
1.4.2 种子形态学指标测定 挑选健康和大小均一的小麦种子(品种:辉县红)。参考文献[10],进行种子形态学指标的测定。试验以无菌水处理作为对照,共设置1×107、1×106、1×105cfu/mL 3个处理和1个对照,每个处理和对照重复4次。7天后统计种子发芽数和根数,测量芽长和根长,并称量芽鲜重和根鲜重。
以产孢量为指标,采用单因素实验筛选菌株TS-1固体发酵培养基的主要成份配比、疏松值、碳源和氮源,确定最适因子。
1.5.1 固体发酵培养基主要成份秸秆与麸皮配比的筛选 主要成份秸秆(玉米)与麸皮(小麦)按体积比为10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,0:10配制7种培养基,每处理重复3次。每200 mL培养瓶中装入50 mL培养基,初始含水量为40%。灭菌后,接入TS-1菌饼3块,25℃恒温发酵5天。取5 g固体发酵物于45 mL无菌水中,搅拌均匀,稀释至适当倍数,吸取100µL均匀涂布于含300µg/mL链霉素的PDA平板上。25℃恒温黑暗培养2天,记录平板上萌发的孢子数。筛选出最佳的主要成份配方比例。
1.5.2 固体发酵培养基疏松值的筛选 在发酵基础培养基中分别按体积比40%添加浸泡过夜的大麦、小麦、高粱、玉米,每处理重复3次。处理方法同1.5.1,筛选出最佳的疏松值。
1.5.3 培养基中大麦含量对菌株TS-1产孢量的影响
在发酵基础培养基中分别按体积比10%、20%、30%、40%、50%添加浸泡过夜的大麦,每处理重复3次。处理方法同1.5.1,筛选出最佳的疏松值(麦粒)含量。
1.5.4 培养基中不同碳、氮源对菌株TS-1产孢量的影响 在发酵基础培养基中分别添加10%碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖)和氮源(硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠),每处理重复3次。处理方法同1.5.1,筛选出最佳碳、氮源。
采用Excel 2010进行数据处理,并采用DPS 2005软件进行单因素方差分析,Duncan氏新复极差法进行处理间差异显著性检验。
该菌株在PSA平板培养基上生长较快,产分生孢子较早且多,也能产生厚垣孢子。该菌株产孢簇为松散羊毛状到紧实的疱状结构,分生孢子梗具有较简单的分枝系统,通常呈直角的1~ 2次分枝,单生或有时成对。瓶梗不规则地在侧面分布,时常单生,安瓿形或柱形,基部常缢缩但不明显;分生孢子单细胞、长方形到椭圆形、绿色、光滑。根据菌株TS-1的培养特性和形态特征,鉴定该菌株为长枝木霉(T.longibrachiatum)。
经测序得到的序列与NCBI基因库中已有的木霉菌EF-1α基因序列进行比对,发现菌株TS-1与GenBank上登录的长枝木霉(EU280033)、长枝木霉(AY865640)和长枝木霉(DQ125467)的菌株同源性均达99%以上,其中与长枝木霉(DQ125467)同源性达100%(图1)。系统发育分析所用的相关长枝木霉菌株背景信息见表1。因此,结合形态学特征,将菌株TS-1鉴定为长枝木霉(T.longibrachiatum)。
图1 基于EF-1α建立的菌株TS-1的遗传聚类分析图谱
表1 相关长枝木霉菌株的背景
结果表明:对峙培养5天时,TS-1对6种病原菌的抑菌率达52.69%~ 73.81%,拮抗系数分别表现为Ⅱ或Ⅱ~ Ⅲ或Ⅲ,其中对茄病镰孢、接骨木镰孢和灰葡萄孢有很强的抑制作用,抑菌率均高达70%以上,3个菌株之间拮抗效果差异不显著(P>0.05),但与禾谷镰孢、拟轮枝镰孢和尖孢镰孢之间拮抗效果差异显著(P<0.05),抑菌率在50%~ 70%之间。上述6种病原菌明显受到长枝木霉菌株TS-1的抑制,其菌落指向木霉菌的半径明显低于对照半径,二者接触后,病原菌菌落长势被削弱,与木霉菌处于对抗僵持状态,部分病原菌交界处木霉菌边缘变得厚实。
表2 TS-1对6个植物病原菌的拮抗作用
与对照相比,长枝木霉菌株TS-1 3个浓度的孢子悬浮液对小麦种子发芽率无显著差异,对小麦的根长和根冠比呈显著差异(P<0.05),有一定的促生作用。其中浓度为1.0×106cfu/mL和1.0×107cfu/mL的孢子悬浮液对小麦各形态学指标(除发芽率外)的影响差异显著,有明显的促生作用。
2.5.1 固体发酵培养基主要成份秸秆与麸皮配比的筛选 由图2表明,菌株接种到不同比例的秸秆与麸皮中,其产孢量差异很大。秸秆:麸皮=9:1时,发酵效果较好,产孢量最高,其对数值达到7.48,与其他各处理间差异显著(P<0.05)。而在秸秆:麸皮=5:5的培养基中产孢量对数值仅为6.10,其与全麸皮培养基中的产孢量对数值差异不显著(P>0.05)。因此,选择秸秆:麸皮=9:1为菌株固体发酵培养基主要成份的最佳配比。
图2 不同配比的秸秆与麸皮对菌株TS-1产孢量的影响
2.5.2 固体发酵培养基疏松值的筛选 菌株接种到大麦、小麦、高粱、玉米分别作疏松值的固体发酵培养基中,实验结果如图3所示,以上4种疏松值对菌株TS-1产孢量对数值的影响差异不显著(P>0.05)。因此,选择产孢量相对较高的大麦作为菌株固体发酵培养基的疏松值。
图3 不同疏松值对菌株TS-1产孢量的影响
2.5.3 培养基中大麦含量对长枝木霉菌株TS-1产孢量的影响 菌株在不同大麦含量的培养基中产孢情况见图4,在供试体积范围内,随着大麦含量的增加,长枝木霉菌株TS-1产孢量逐渐降低。当麦粒添加量为50%时,产孢量最少,其对数值为7.25,与其他各处理间差异显著(P<0.05)。而麦粒添加量在10%、20%和30%之间差异不显著(P>0.05),选择添加10%的大麦粒,产孢量相对较高。
图4 不同大麦含量对菌株TS-1产孢量的影响
表3 不用浓度的长枝木霉菌株TS-1对小麦形态学指标的影响
2.5.4 培养基中碳源和氮源对长枝木霉菌株TS-1产孢量的影响 菌株TS-1在3种碳源和氮源条件下均能产孢(图5,图6)。当添加乳糖时,产孢量最大,其对数值达到7.56,与添加蔗糖条件下产孢量对数值之间差异不显著(P>0.05),但与添加葡萄糖条件下产孢量对数值差异显著(P<0.05)。当添加硫酸铵时,产孢能力最强,产孢量最大,其对数值达到6.72,但经方差分析可知3种氮源产孢量之间差异不显著(P>0.05),说明氮源对菌株TS-1的产孢量影响不大。
图5 不同碳源对菌株产孢量的影响
图6 不同氮源对菌株产孢量的影响
每种木霉在生防功能与代谢产物上都不尽相同,因此,准确的分类鉴定对其在农林生产中的应用具有 重要意义。在研究木霉菌株生防潜力之前必先清楚其分类地位,以免造成混淆以及在制剂生产过程中不必要的烦扰[27]。通过形态学来确定木霉菌的分类地位向来是研究者的一个难题,因为同一属的不同菌种,特别是相近种在形态学上的差别不大。单从形态特征等方面去确定木霉菌的种间分类地位,其鉴定结果的准确性很难令人信服。翻译延伸因子1A(elongation factor 1 alpha,EF-1α)是一个非常重要的多功能蛋白,其序列在不同物种中高度相似,被广泛地用来进行种系发生分析[28]。研究表明利用EF-1α对木霉菌进行种间的分类鉴定是稳定可行的,崔岩等[26]利用延伸因子对中国木霉新记录种俄罗斯木霉(T.rossicum)进行了分类学地位确定。因此,本研究在形态学比对的基础上,采用EF-1α基因序列分析作为辅助鉴定手段,提高了菌株TS-1鉴定的准确性。
国内外大量的研究结果表明,木霉菌的抑菌作用具有广谱性,集定殖能力强和多种拮抗机制并存等优势。本试验同时针对禾谷镰孢、尖孢镰孢、拟轮枝镰孢、茄病镰孢、接骨木镰孢和灰葡萄孢等6种病原真菌采用对峙培养法进行拮抗作用的测定,均有较好的抑菌效果。木霉生长速度显著快于其余病原菌,在营养及空间上主要通过分生孢子梗与气生菌丝的扩展达到占领生存空间的目的。由于不同的病原菌菌丝生长能力与产孢时间不完全相同,长枝木霉TS-1对几种病原菌的抑菌作用效果稍有不同。其中,对茄病镰孢和接骨木镰孢有较好的抑制作用,与崔岩等[26]报道俄罗斯木霉GAU1-X-2的研究结果较一致,这可能与2个菌株均来源于同一地区、同一作物根际土壤有关。关于长枝木霉TS-1对灰葡萄孢的拮抗作用,与前人研究结果基本一致[29-30]。本研究还发现该菌株对小麦形态学指标具有较明显的促生作用,与Zhang等[11]研究结果一致。在小麦苗期,可通过喷施该菌株的孢子悬浮液增大其根冠比,促进植物地下部分根系生长,进而促进地上部分茎、叶生长量。
大规模应用木霉固体发酵产物防治病害,首先必须筛选获得既高效又经济的培养基质,培养基质是影响木霉产孢量的重要因素。本试验通过单因素实验优化木霉发酵条件,选择麸皮等农业废弃物,可刺激木霉菌在土壤中的增殖。添加大麦粒作为疏松值,可增加培养基的透气性,有利于产孢[31]。筛选出的培养基中添加乳糖与蔗糖时,产孢量最大。但蔗糖较乳糖廉价易得,作为碳源用于发酵更具可行性。筛选出的培养基中分别添加硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠3种无机氮源时,硫酸铵、硝酸铵的产孢能力均强于硝酸钠,但三者对产孢量的影响不显著,这与前人的研究结果一致[32],木霉对氮的适应性很强,但对铵盐的利用优于硝酸盐。上述试验说明长枝木霉TS-1所使用发酵材料较为廉价易得,可进行大量扩繁,投入生产,具有制成生防制剂的潜力。
长枝木霉TS-1是从甘肃马铃薯连作田根际土壤中分离得到的一株具有良好抑菌促生作用的菌株,其对禾谷镰孢、尖孢镰孢、拟轮枝镰孢、茄病镰孢、接骨木镰孢和灰葡萄孢等6种病原真菌的抑菌率均在50%以上,对小麦形态学指标具有较明显的促生作用,所使用的固体发酵材料廉价易得,产孢量大。综上,该菌株具有较好的生防应用潜力。但田间情况复杂,木霉群体的定殖能力和生存能力受到一定的限制,其生防效果不稳定。因此,有关该菌株对植物病原菌的作用机理以及在田间的定殖能力和防治效果还有待于进一步试验和研究。