高效液相色谱法测定啶氧菌酯悬浮剂及水分散粒剂中有效成分含量

马腾飞，贾孙悦，刘 琳，周 芹,3,4，高金胜

（1黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨150080；2黑龙江大学化学化工与材料学院，哈尔滨150080；3农业农村部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨150080；4农业农村部糖料产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨150080）

0 引言

啶氧菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类农药，是一类低毒、高效、广谱的杀菌剂，20世纪80年代发展起来并且在90年代首次引入市场[1]，由于其良好的环境相容性，在短短十余年时间已成为农用杀菌剂中的主流产品之一，销售市场已超过三唑类，在各类杀菌剂中位列首席[2]。这类杀菌剂的活性位点是甲氧基丙烯酸（酯/酰胺），通过抑制真菌的线粒体呼吸链中细胞色素Bcl复合物活性，从而抑制线粒体的呼吸作用，阻断电子传递，干扰真菌体内的能量循环，抑制真菌的生长[3]。

甲氧基丙烯酸酯类农药主要包括啶氧菌酯、肟菌酯、醚菌酯、嘧菌酯[4]、吡唑醚菌酯[5]和烯肟菌胺等十余个品种[6]。啶氧菌酯化学名称为(E)-3-甲氧基-2-{2-[6-(三氟甲基)-2-吡啶氧甲基]苯基}丙烯酸甲酯，主要用于防治麦类叶面病害[7]，如叶枯病、叶锈病、颖枯病、褐斑病、白粉病等[8]，与现有其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂相比，对小麦叶祜病、网斑病和云纹病有更强的治疗效果[9]。在中国，啶氧菌酯还用于水稻稻曲病等病害的防治，其使用范围和使用量正逐步上升。目前，对啶氧菌酯检测主要集中在残留的检测[1,10-13]，Gao等[9]利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱，前处理采取改良的QuEChERs方法，同时检测辣椒中啶氧菌酯和吡唑醚菌酯含量，回收率及相对标准偏差(RSD)均满足分析要求。劳斐等[14]建立了黄瓜中啶氧菌酯残留量的检测方法，当添加浓度在0.02 mg/kg～ 0.10 mg/kg水平时，回收率在88.2%～ 101.9%之间，RSD值为1.2%～ 2.6%，该方法重现性好、灵敏度高、检测限低。杨雅雅等[15]利用QuEChERs前处理，气相色谱-质谱联用建立了苹果中啶氧菌酯和四螨嗪的测定方法，简单快速，具有很好的精密度及准确度。无论是色谱法[16-17]还是色谱-质谱联用[9-10,13-15,18-20]的方法，都是针对啶氧菌酯残留的检测，基质包括土壤和植株等等，制剂的有效成分检测方法则报道较少。而随着农业产业和使用技术的发展，中国农药产品已由单一品种向复配农药转化，且农药产品质量也参差不齐，还有部分农药企业在产品中添加标示外的农药成分，给检测部门带来了一定的困难。中国《农药管理条例》对假农药做了严格规定：农药所含有效成分种类与农药的标签、说明书标注的有效成分不符，一律认定为假农药[21]。所以，对制剂有效成分的检测具有重要意义。本实验拟解决的关键问题在于建立一种方法可以同时适用于啶氧菌酯悬浮剂（suspension concentrate，简写为SC）及水分散粒剂（water dispersable granule，简写为WG）中有效成分的检测，采用反相高效液相色谱法，通过优化流动相比例、波长扫描、纯度检验等等，建立的方法完全满足上述要求，用于具有灵敏度高，操作简便的特点，同时，为国家标准的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪：Aglient1260，二极管阵列监测器(DAD)。色谱数据处理机或色谱工作站。色谱柱：250 mm×4.6 mm(i.d.)不锈钢柱，内装Waters Symmetry-C18、5 μm 填充物。过滤器 ：滤膜孔径约0.45 μm。微量进样器：50 μL。定量进样管：5 μL。KQ-250DB型数控超声波清洗器，密理博纯水器(Millipore,El Passo,TX,USA)。

1.1.2 试剂 乙腈：色谱纯；水：新蒸二次蒸馏水或超纯水；啶氧菌酯标样：已知啶氧菌酯质量分数为98.0%(TM standard)。

1.2 实验方法

1.2.1 液相色谱条件 流动相:Ψ（乙腈:水）=80:20，经滤膜过滤，并进行脱气；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；检测波长：220 nm；进样体积：5µL。

1.2.2 测定步骤

（1）标准溶液的制备

称取0.05 g（精确至0.000 1 g）啶氧菌酯标样于100 mL容量瓶中，加入20 mL乙腈，超声波振荡5 min，冷却至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀。

（2）试样溶液的制备

称取含0.05 g（精确至0.000 1 g）啶氧菌酯的试样于100mL容量瓶中，加入20mL乙腈，超声波振荡5min，冷却至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤。

（3）测定

在上述操作条件下，待仪器稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻两针啶氧菌酯峰面积相对变化小于1.2%时，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。

2 结果与分析

2.1 实验条件的选择

2.1.1 吸收波长的选择 啶氧菌酯分子内含有不饱和的共轭双键，所以在紫外区具有吸收，为了获得啶氧菌酯的最大吸收波长，利用高效液相色谱配置的二极管阵列检测器，在紫外区进行全波长扫描(200～ 400 nm)。结果如图1所示，从图中可以看出啶氧菌酯的最大吸收波长约在220 nm，在该波长处灵敏度较高，干扰较少，能够满足分析的要求，故将检测波长确定为220 nm。

图1 啶氧菌酯的紫外光谱图

2.1.2 色谱柱及流动相的选择 根据啶氧菌酯的性质，色谱柱选择常用的C18反相柱。反相液相色谱最常用的溶剂包括甲醇、乙腈等等，虽然啶氧菌酯在甲醇中溶解度较大[22]，但是在波长220 nm的情况下，甲醇的紫外吸收对目标物会产生干扰，所以综合考虑选择乙腈作为溶剂溶解样品，并以乙腈和水作为流动相。随着乙腈比例的增加，保留时间减小，最终的比例选择（乙腈:水）=80:20，流速1.0 mL/min。该条件下，啶氧菌酯色谱峰峰形较好（图2～ 图3），与杂质能完全分离，具有良好的精密度和准确度，并且分析时间较短。

图2 啶氧菌酯水分散粒剂HPLC图

图3 啶氧菌酯悬浮剂HPLC图

2.2 峰纯度检验

在色谱分析中，色谱峰的纯度鉴定对于复杂物质的分析具有重要的意义[23]。利用高效液相色谱的二极管阵列检测器（简写为PDA或者DAD）可以实现对峰纯度的检测，本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别啶氧菌酯。50%啶氧菌酯水分散粒剂和22.5%啶氧菌酯悬浮剂中的啶氧菌酯HPLC-PDA峰纯度因子均大于950，啶氧菌酯不存在同分异构体，所以有效成分处无其他物质干扰，符合定量分析要求。峰纯度色谱图见图4～ 图5。

图4 50%啶氧菌酯水分散粒剂HPLC-DAD峰纯度色谱图

图5 22.5%啶氧菌酯悬浮剂HPLC-DAD峰纯度色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的线性范围 按1.2.1标样溶液的制备方法配制5个不同浓度的有效成分线性相关溶液，分别标记为STD1～ STD5。在上述操作条件下，待仪器稳定后，按照STD1～ STD5的顺序测定每个溶液中啶氧菌酯的峰面积，取2次测定的平均结果。以啶氧菌酯质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见图6。从图6可以看出，当啶氧菌酯质量浓度在100.1～ 1000.8 mg/L之间（进样体积5µL），与相应的啶氧菌酯峰面积之间呈现良好的线性关系，计算得回归方程为y=9827.8x+6154.3，相关系数R2=0.9993，完全可以满足定量分析要求。

图6 啶氧菌酯峰面积与质量浓度关系图

2.3.2 方法精密度试验 精密度一般用偏差、标准偏差或者相对标准偏差来表示，本实验对同一种农药制剂进行了5次测定，计算结果的标准偏差及相对标准偏差。按1.2.2试样溶液的制备方法分别配制5个22.5%啶氧菌酯悬浮、5个50%啶氧菌酯水分散粒剂精密度溶液，分别标记为SC-A1至SC-A5、WG-A1至WGA5。分别以STD-SC-A、STD-WG-A为标样溶液，在上述色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、精密度溶液、精密度溶液、标样溶液的顺序进行测定，结果见表1～ 表2。

农药测定和分析方法中，数据结果的合格性应以修改的Horwitz公式(2(1-0.51ogC)×0.67)为依据[24]，RSD值小于这个修正值通常被认为是合格的。从表1、表2可以看出，22.5%啶氧菌酯悬浮剂中啶氧菌酯质量分数测定结果的RSD为1.31%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=2.09（其中C=0.2274），50%啶氧菌酯水分散粒剂中啶氧菌酯质量分数测定结果的RSD为0.69%，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.65，（其中C=0.5053），表明有效成分分析方法精密度的测定结果符合要求。

表1 22.5%啶氧菌酯悬浮剂中啶氧菌酯精密度试验结果

表2 50%啶氧菌酯水分散粒剂中啶氧菌酯精密度试验结果

2.3.3 方法准确度试验 利用在农药制剂中添加标准品的方法来验证方法的回收率，分别称取含0.025 g（精确至0.000 1 g）啶氧菌酯的22.5%啶氧菌酯悬浮剂、50%水分散粒剂于100 mL容量瓶中，再分别加入啶氧菌酯标样0.025 g（精确至0.00001 g），按试样溶液的制备方法配制5个有效成分准确度溶液，标记为SCB1～ SC-B5、WG-B1～ WG-B5。以STD-B为标样溶液，在上述液相色谱操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标样溶液、准确度溶液、准确度溶液、标样溶液的顺序进行测定，结果见表3～ 表4。

表3 22.5%啶氧菌酯悬浮剂回收率试验结果

表4 50%啶氧菌酯水分散粒剂回收率试验结果

实验结果表明，22.5%啶氧菌酯悬浮剂中啶氧菌酯平均回收率为100.64%，50%啶氧菌酯水分散粒剂中啶氧菌酯平均回收率为99.74%，具有良好的准确度。

2.3.4 不同实验室方法验证 为了验证建立的方法在不同实验室的适用性，分别在3个不同实验室进行了方法验证实验，实验结果见表5。从统计结果看，22.5%啶氧菌酯悬浮剂、50%啶氧菌酯水分散粒剂重复性相对标准偏差分别为0.8052%、0.6003%，再现性相对标准偏差RSDR分别0.8560%、1.5625%，都小于相应的Horwitz公式理论计算值，表明不同单位间的检测结果符合性良好，本研究报告建立的啶氧菌酯液相色谱分析方法可以满足日常检测工作需要。

表5 不同实验室方法验证结果统计表

3 结论与讨论

目前的研究结果主要集中在啶氧菌酯残留的检测方面，对于农药制剂的有效成分报道较少，采用同一种方法进行啶氧菌酯两种制剂有效成分的测定则未见报道。本研究利用高效液相色谱-紫外检测器，乙腈溶解样品，检测波长220 nm，乙腈-水作为流动相，等度洗脱，建立了在同一条件下啶氧菌酯水分散粒剂及悬浮剂的测定方法。

高效液相色谱测定波长一般利用二极管阵列监测器进行全波长扫描，得出样品溶液的最大吸收波长，除此之外，还要避开其它物质的干扰。本实验选用220 nm作为测定波长，在此波长处响应值最高，干扰较小。并进行了色谱峰特异性检验（纯度检验），多数情况下，纯度检验可以辅助人们进行方法开发[26]。不同物质具有不同的紫外吸收光谱，但是对于具有手性对映异构体的物质，无法实现色谱峰纯度的检测。鉴于啶氧菌酯不存在手性异构体，可以通过纯度检查色谱峰是否为单一物质峰。本实验中峰纯度均满足要求。

农药制剂有效成分的提取一般会考虑各方面的影响因素[25]，首先根据农药在不同溶剂中的溶解度，其次要兼顾液相色谱所用的流动相及吸收波长。本实验选择乙腈作为提取溶剂溶解样品。实际上，啶氧菌酯在甲醇中的溶解度高于乙腈，而且甲醇的成本相对较低，所以，首先选用甲醇溶解样品，但是由于甲醇存在干扰，色谱峰峰形较差，而且实验中选用的波长为220 nm，为了减小对目标物的干扰，最终选择乙腈溶解样品。在反向色谱柱方法开发中，广泛使用的两种常见的流动相是甲醇和乙腈。用甲醇做流动相，紫外波长需要设置大于230 nm，而乙腈则大于210 nm即可。另外从色谱峰形上来看，乙腈的粘度较甲醇小，从速率方程角度说，流动相传质阻抗小，有利于柱效提高，色谱峰较窄，峰形较好。啶氧菌酯保留时间在6 min左右。本方法具有操作简单、节省时间、灵敏度高、准确性及重现性好等优点，目前正在探索多种农药制剂有效成分的联合检测方法，以期获得更高的效率。

本研究建立的啶氧菌酯的测定方法，两种制剂中啶氧菌酯的回收率分别为100.64%、99.74%，测定结果的相对标准偏差(RSD)值分别为1.31%、0.69%。准确度、精密度、RSD值均满足分析要求，适用于啶氧菌酯水分散粒剂及悬浮剂中有效成分的测定。