正交法优化‘胭脂萝卜’红色素超声提取工艺

彭 华，宋 霞，张 春

（1四川旅游学院旅游文化产业学院，成都610100；2四川旅游学院旅游农业发展研究中心，成都610100；3西南医科大学药学院，四川泸州646000）

0 引言

萝卜(Raphanus sativusL.)属于十字花科萝卜属植物，是一年生或二年生植物，在中国分布广泛，种类繁多[1]。‘胭脂萝卜’是重庆市涪陵区两江交汇处特有的地方萝卜品种，据记载已有100多年的历史，它的肉质根和根皮均为深红色，富含萝卜红色素，是提取天然红色素的好原料[2]。萝卜红色素的主要成分为天竺葵素的葡萄糖酐衍生物，为花色素苷类物质，其水溶液最大吸收波长在530 nm处[3-4]。萝卜红色素具有纯天然无毒害、生产成本低、周期短、来源丰富以及有一定的营养和药效价值等特点，适合用于食品、医疗、美妆、服装等行业的添加剂和染色剂，是中国规定可以使用的天然食用色素之一[5-9]。

目前关于萝卜红色素的研究主要集中在色素提取工艺、分子合成机制及理化性质等方面[10-11]。在红色素提取方面，研究表明萝卜红色素易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，在温度大于60℃和阳光照射下稳定性会降低，而酸性条件下稳定性较高[12-14]。除常规浸提法外，超临界CO2萃取法[15]、微波提取法[16]和超声波辅助法[17]等辅助方法的运用能够一定程度的提高萝卜红色素得率。前人曾经尝试提取‘涪陵胭脂萝卜’红色素，但由于条件有限，制得的产物易结块且萝卜气味较大[17]。目前的研究主要集中于提高萝卜红色素的稳定性以及有效的去除萝卜味，对‘胭脂萝卜’提取工艺系统化及比较分析研究较少[18]。在提取工艺优化的研究中运用乙醇、乙酸等单一溶剂较多[19-21]，而多种溶剂配合运用的研究较少，因此，胭脂萝卜红色素提取工艺优化的研究值得进一步深入。

本研究采用超声波辅助提取法提取‘胭脂萝卜’红色素，研究了乙醇、盐酸、丙酮和盐酸-丙酮复合溶液提取剂、料液比、提取温度和提取时间对‘胭脂萝卜’红色素吸光值的影响，并对几个萝卜种质的红色素提取液吸光值进行了比较研究，为‘胭脂萝卜’红色素的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验选用了7个不同肉质颜色的萝卜，分别为‘野生萝卜’、‘西昌白萝卜’、‘大红袍’、‘红心 1 号’、‘胭脂红1号’、‘胭脂红2号’和‘罐罐萝卜’。其中‘胭脂红2号’用于红色素提取工艺优化研究。试验于2019年12月—2020年5月在四川旅游学院烹饪科学重点实验室进行。

1.2 试剂与仪器

浓盐酸、无水乙醇、丙酮等均为分析纯，购自成都市科龙化工试剂厂。试验主要使用的化学仪器列于表1。

表1 试验主要仪器

1.3 萝卜红色素提取、测定流程

取‘胭脂红2号’肉质根洗净，切成厚约1 mm的薄片，烘干至恒重后粉碎，制得胭脂萝卜干碎片。准确称取1.000 g的上述碎片置于离心管中，量取一定量的提取液，放入超声波清洗机中在一定温度条件下浸提一定时间，将浸提液于3000 r/min离心3 min，取上清定容至25 mL，于波长530 nm下测定吸光值。

1.4 提取液的选择

提取液分别为乙醇和丙酮的体积分数10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%水溶液，盐酸的质量分数3.6%、7.2%、10.8%、14.4%、18.0%、21.6%、25.2%、28.8%、32.4%、36.0%水溶液。以上述溶液为提取液，超声浸提条件为50℃浸提20 min，采用1.3所述流程进行色素提取并测定吸光值。

1.5 提取条件的选择

研究料液比、提取温度、超声频率对‘胭脂萝卜’红色素提取率的影响，首先做单因素试验考察以上条件对提取率的影响，然后采用正交试验法优化最佳工艺条件。

1.5.1 提取液配比的选择 将10.8%的盐酸溶液和30%丙酮溶液配制成比例分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的溶液作为提取液，取10 mL加入离心管中，称取萝卜碎片1.000 g加入离心管，超声浸提条件为50℃浸提20 min，按1.3中结所述流程提取色素并测量吸光值，重复3次。

1.5.2 料液比的选择 称取萝卜碎片1.000 g，取1.5.1中研究所得的最适提取液2 mL（料液比1:2 g/mL），4 mL（料液比1:4 g/mL），6 mL（料液比1:6 g/mL），8 mL（料液比1:8 g/mL），10 mL（料液比1:10 g/mL），12 mL（料液比1:12 g/mL）加入离心管，超声浸提条件为50℃浸提20 min，按1.3小节所述流程提取色素、定容并测量吸光值，重复3次。

1.5.3 提取温度的选择 取1.5.1中所得的最适提取液10 mL加入离心管中，称取萝卜碎片1.000 g加入离心管，设置提取温度为20、30、40、50、60℃，浸提20 min，按1.3中所述流程提取色素并测量吸光值，重复3次。

1.5.4 提取时间的选择 取1.5.1中所得的最适提取液10 mL加入离心管中，称取萝卜碎片1.000 g加入离心管，设置提取时间为20、40、60、80、100 min，超声浸提条件为50℃，按1.3中所述流程提取色素并测量吸光值，重复3次。

1.5.5 正交试验设计 在单因素实验的基础上，为了获得提取萝卜红色素的最佳工艺条件，采用正交设计法，选用正交设计表L16(45)进行表头设计，共设3个因素，分别为提取液配比、料液比、提取温度。按各试验号依次完成试验，每个试验号设3次重复，以3次重复的吸光值进行正交分析。

1.6 数据处理

利用Microsoft Office Excel 356进行数据的整理和作图，利用DPS 7.05软件进行统计分析[22]。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

2.1.1 提取液的选择 乙醇浸提从0%～ 30%呈上升趋势，30%～ 100%呈下降趋势，因此，乙醇溶液浸提萝卜红色素的最适浓度为30%。盐酸浸提从0%～ 3.6%呈上升趋势，但3.6%～ 36.0%之间只有轻微变化，因此确定盐酸提取萝卜红色素的最适浓度为3.6%。丙酮浸提从0%～ 30%呈上升趋势，30%～ 100%呈下降趋势，因此丙酮浸提萝卜红色素的最适浓度为30%（图1）。3种溶剂浸提萝卜红色素效果的顺序为：盐酸＞丙酮＞乙醇，其中盐酸浓度为10.8%时吸光值最高，为2.054，乙醇和丙酮浓度为30%时吸光值最高，分别为1.428和1.105。

图1 不同浓度盐酸、乙醇和丙酮对萝卜红色素提取液吸光值的影响

2.1.2 提取液配比的选择 为了进一步提高提取率，尝试将浓度均为10.8%的盐酸溶液和30%的丙酮溶液按比例1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1配置成提取液进行试验。结果表明，不同盐酸和丙酮溶液的比例在1:9到5:5的过程中提取效率越来越高，在5:5到9:1的过程中，吸光值依次下降，所以我们可以得到浸提萝卜红色素效果最适比例为5:5（图2）。并且高于单独使用盐酸或丙酮。故选定3:7、4:6、5:5、6:4为正交试验的4个水平。

图2 提取液配比对吸光值的影响

2.1.3 料液比的选择 溶剂的用量过低，因萝卜红色素饱和而提取不完全，导致提取率偏低；溶剂用量过大，提取液中有效成分的浓度降低，导致提取效率降低，还会造成溶剂的浪费[23-24]。在控制时间和浸提温度不变的条件下，考察不同料液比对浸提萝卜红色素的影响，料液比从1:2降低到1:6的过程中提取液的吸光值增加，从1:6降低到1:12的过程中，提取液的吸光值逐渐减少（图3）。料液比在1:6时浸提到的萝卜红色素含量最高，故选定1:4、1:6、1:8、1:10 g/mL为正交试验料液比的4个水平。

图3 料液比对吸光值的影响

2.1.4 提取温度的选择 温度对提取率的影响主要有2方面，一方面能提高色素在提取液中的溶解度，另一方面高温下色素自身分解，盐酸和丙酮会加速挥发，从而降低色素在提取液中的溶解度[25]。由图4可知，随着提取温度的提高，提取率呈先增大再持平后减小的趋势，当提取温度为50℃时，提取率较高，60℃时提取率下降。因此，选定30、40、50、60℃为正交试验提取温度的4个水平。

图4 提取温度对吸光值的影响

2.1.5 提取时间的选择 考察提取时间对浸提液吸光值的影响，结果表明浸提的时间从20～ 100 min的过程中，吸光值呈下降趋势，说明红色素溶于盐酸丙酮溶液的速度很快，20 min已经能够达到最大值。从20～ 60 min的过程中，下降的较为明显，60～ 100 min变化不太明显（图5）。降低的原因可能是提取时间过长增加盐酸和丙酮蒸发，从而降低色素在提取液中的溶解度。由数据分析可得出萝卜红色素浸提的最适时间为20 min。

图5 提取时间对吸光值的影响

2.2 正交试验

根据单因素试验的结果，选取试验提取液配比、料液比、提取温度等3项因素中有意义的水平确定正交试验方案（表2）。试验完成后，对结果进行方差分析，计算各因素平均值和极差，以确定最佳的提取条件。

表2 正交试验方案及结果

正交试验的直观分析结果列于表3～ 表5。由表3方差分析表明，提取液配比对吸光值影响达显著水平，料液比、提取温度和料液比×温度互作对吸光值影响达极显著水平，而料液比×提取液配比互作对吸光值的影响不显著。因此，有必要对料液比、提取温度、提取液配比和料液比×温度互作进行因素内多重比较。同因素中不同水平的结果均值反映了不同水平在该因素中对结果的影响，极差的大小反映了该因素的变化对结果影响的大小，由此可见对吸光值的影响从大到小依次为提取温度、料液比、料液比×温度互作和提取液配比。

表3 正交试验方差分析表

2.2.1 料液比对吸光值的影响 料液比的极差分析结果在5个因素中居第2位，因此，试验中优化料液比是保证高提取率的重要因素。表4显示，当料液比为水平3即1:8时吸光值最大，因素内的多重比较表明，水平3（料液比=1:8）与水平2（料液比=1:6）达显著差异，与水平4（料液比=1:10）和水平1（料液比=1:4）差异达极显著水平。因此料液比选择水平3（料液比=1:8）为宜。.

2.2.2 提取温度对吸光值的影响 提取温度的极差分析结果在5个因素中居第1位，因此，试验中优化提取温度是保证高提取率的首要因素。表4显示，当提取温度为水平3即50℃时吸光值最大，因素内的多重比较表明，水平3与其他水平相比均达极显著差异，因此50℃是提取温度的最佳选择。此外，正交分析结果表明料液比×温度互作对吸光值的影响极显著，可能是由于温度影响了红色素的溶解度，在高料液比的情况下，溶液饱和后温度越高，红色素溶解度越高，从而吸光值越高。二者互作的极差分析结果在5个因素中居第3位，对吸光值的影响低于提取温度和料液比，因此不必考虑两者互作对最优提取条件的影响。

表4 因素均值表

2.2.3 提取液配比对吸光值的影响 由表5可知，盐酸丙酮提取液配比和料液比×提取液配比互作的极差在5个因素中是最小的2个，比另外3个因素少了1个数量级，说明酸化丙酮提取液配比和料液比×提取液配比互作对吸光值的影响是5个因素中最小的。由表4可知，提取液配比的4个水平中，水平3即盐酸：丙酮=5:5的吸光值是最大的，因素内的多重比较表明，水平3和水平2（盐酸：丙酮=4:6）、水平 4（盐酸：丙酮=6:4）差异不显著，和水平1（盐酸：丙酮=3:7）差异显著。因此，10.8%盐酸：30%丙酮=6:4、4:6和5:5均可作为提取液配比的配方。

表5 因素极差表

综上，提取‘胭脂萝卜’红色素的条件可优化为：提取料液比取1:8，提取温度取50℃，提取液选用盐酸丙酮提取液，其配比为10.8%的盐酸:30%的丙酮=1:1，提取时间选20 min。但这个处理组合不在正交设计试验中，故进一步以该组合做补充实验。结果表明，3次重复的平均吸光值为2.311，高于正交试验中吸光值最高的7号处理，证实了试验得出的理想组合确实是最佳组合。

2.3 不同颜色萝卜红色素含量

用优化后的方法提取并比较了7个萝卜品种萝卜根皮和萝卜肉质根的红色素提取液的吸光值。统计发现，各材料间的吸光值存在显著或极显著差异，且吸光值和萝卜颜色关系密切，即目测颜色较深的萝卜，吸光值也较大，白萝卜的吸光值最低（表6）。此外，数据表明萝卜根皮的吸光值高于萝卜肉质根的吸光值，说明萝卜根皮的红色素含量高于肉质根。

表6 不同萝卜品种红色素提取液吸光值

3 结论与讨论

浸提法是萝卜红色素的主要获取方法之一，萝卜红色素在酸性条件下具有较好的稳定性且易溶于极性分子，采用浸提法提取萝卜红色素常用的溶剂主要有乙酸、水、柠檬酸、乙醇等极性和酸性溶剂，最高产率能达到3%左右[26]。本研究在前人对各种溶剂筛选的基础上，试图通过复合溶剂进一步提高萝卜红色素的提取率，结果表明在本研究条件下，盐酸丙酮复合溶剂所得的红色素提取液的吸光值高于仅用盐酸或丙酮的吸光值。前人研究表明，复合溶液提取可以获得更高的提取率，张晶晶[27]研究发现0.15 mol/L盐酸-65%乙醇复合溶剂提取彩叶草色素的效果最佳，于开源等[28]研究表明乙醇:水:石油醚=1:2:6混合溶剂是提取南瓜β-胡萝卜色素的最优溶剂，本研究结果说明萝卜红色素提取率可以通过复合溶剂得到进一步提高，这是对前人研究结果在萝卜红色素提取上的扩展，也为进一步提高萝卜红色素提取的效率提供了参考。熊勇等[14]以柠檬酸溶液为溶剂，提出萝卜红色素最佳提取工艺条件为：提取温度为43.07℃、提取pH 2.88、提取时间为3.65 h、料液比为1:4，在此条件下提取率为65.21%。闫亚茹等[29]通过热水浸提法筛选提取萝卜红色素的最佳条件，结果发现，当提取温度达到65℃、提取时间100 min、提取料液比为35:1时，提取的效率最高，三者对萝卜红色素的提取效率影响力度为提取时间＞提取料液比＞提取温度。本研究结果表明，提取液配比对吸光值影响达显著水平，料液比、提取温度对吸光值影响达极显著水平，对吸光值的影响从大到小依次为提取温度、料液比和提取液配比。在提取料液比取1:8，提取温度取50℃，提取液选用盐酸丙酮提取液，其配比为10.8%的盐酸:30%的丙酮=1:1，提取时间选20 min的条件下，红色素提取液吸光值最高，但由于与前人研究所用萝卜原材料和提取溶剂不尽一致，故本研究与前人所得结论存在一定差异。

本研究还利用优化后的提取工艺对红心萝卜种质资源进行了评价，发现7份萝卜种质中以‘胭脂红2号’色素含量最高，萝卜根皮的色素含量比肉质根更高，该结果为萝卜红色素进一步开发和利用提供了理论依据。