两种野生大豆不同生育期光合特性及染色体核型比较

田 鑫，钟 程，罗 欢，李雪飘

（凯里学院大健康学院，贵州凯里556011)

0 引言

野生大豆(Glycine soja Sieb.&Zucc.)是栽培大豆的近缘野生物种，属于蝶形花科大豆属一年生草本植物。野生大豆茎叶可作饲料，种子可食用，全株可入药，是非常重要的野生资源，在农牧业育种方面也凸显重要作用[1]。野生大豆因其资源多、分布广、蛋白含量高、品质特异[2]，具有抗逆境胁迫的适应能力强、遗传多样性丰富，蕴藏着多种适应各种生态环境的独特基因资源[3]。野生大豆对于丰富栽培大豆基因型、种质资源创新及遗传改良方面具有重要作用[4]。但因其粒小、蔓生、易裂荚等的特性一直未能充分开发利用，叶绿体是叶片光合作用中心，对干物质的积累有重要影响，因此，光合参数直接影响作物产量[5]，生产上光合作用是影响大豆产量和品质的关键因素，光和能力强弱直接关系到产量和品质的积累[6]，通过筛选高光合野生大豆材料是提高大豆光合效率的有效途径。对于同一作物不同品种间或同一品种个体间的光和能力存在差异，Sakoda[7]研究了不同基因型大豆的光合能力，找出了其中光合能力强的品系14。关于大豆光合特性研究大多集中在栽培品种，遗传基础狭窄。近年来通过野生大豆改良大豆品种，已筛选出优质、抗性强的材料[8]。但是，关于野生大豆在光合特性方面的研究较少。主要研究关于野生大豆与栽培品种的杂交后代的光合变化[5,9]或野生大豆在逆境胁迫下对光合作用产生的影响[10]，除对野生大豆进行光合特性研究之外，在染色体核型上也有一定研究。Ahmad等[11]用数量统计方法分析得到野生大豆核型为2n=24m+14sm+2st。Ladizinsky等[12]发现大豆染色体C带拥有4种不同带型。郑惠玉等[13]发现野生大豆染色体有4个随体现象。钟珍萍等[14]等发现3种野生大豆都含有1对最长染色体随体。因此，野生大豆染色体带型种类繁多，结合黔东南州野生大豆资源，开展该地区野生大豆染色体核型研究对深入系统开发和选育新种质提供可靠的理论依据。本研究以前期收集到的两份野生大豆为材料，通过光合指标的测定，比较不同类型的野生大豆的光合能力强弱，以期获得较高光合能效的野生大豆材料，为后续的大豆遗传改良提供方法和材料基础。同时对根尖染色体核型进行比较，对挖掘作物的亲缘关系和指导后续杂交育种具有重要意义，为物种进化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料于2017年12月在丁扒山和凯里学院收集获得（由黔东南州林业局高级农艺师王定江鉴定），于2018年3月12日播种于凯里学院实验地，整个生长期进行常规管理。两种野生大豆外观形态差异表现为：丁扒山野生大豆（丁豆）的叶片椭圆、花期为10月上旬至11月上旬、花色为淡紫色、豆荚边缘褐色绒毛、豆荚光滑；凯里学院野生大豆（凯豆）叶片为披针形、花期为8月中旬至9月下旬、花小且花色为紫色、豆荚附有褐色绒毛。

1.2 方法

1.2.1 叶绿素含量测定方法 使用SPAD-502 Plus测定叶绿素含量，测定方法同光合特性测定。

1.2.2 各生育期光合特性测定 根据Fehr等[15]提出的大豆生育期鉴定方法，研究其营养期25节期(V25)、盛花期(R3)、结荚期(R5)3个时期，每个时期于晴天上午8:00—18:00选择生长健壮、长势一致且无病虫害植株各3株，在各株的同一部位和同一方向选取3片叶进行测定，重复3次取平均值。每隔2 h测定一次，待数值稳定后记录其净光合速率(Pn)、胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、光强(Par)。

1.2.3 光响应曲线的测定方法 光响应曲线测定采用LI-6400XT红蓝光源。测定时间为9:00—14:00，光合有效辐射梯度为2000、1600、1200、800、400、200、100、50、20、0 μmol/(m2·s)。每次测定前矫正 15～ 20 min。CO2浓度为 500 μmol/(m2·s)，记录 Pn、Ci、Gs、Tr等指标。用叶子飘等[116]提出的修正模型对曲线进行拟合。

1.2.4 根尖染色体处理 于8:00—9:00选取长势良好粗壮无病虫害的根尖，采用AEG法进行处理[17-18]。选取乳白色根尖1 mm左右进行展开压平，用Giemsa染液染色10～ 15 min，烤片1～ 2 min，在OLYMPUS-BX53荧光显微镜观察拍照。核型类型划分及核型不对称系数计算分别参照李懋学[17]和Arano[18]的方法。

1.2.5 数据分析及图片制作 采用SPSS 23软件进行数据分析，用DPS进行光合拟合，Photoshop完成作图。

2 结果与分析

2.1 不同时期叶绿素含量的变化

由图1可知，两种野生大豆在营养期(V25)的差异不显著，在盛花期和结荚期凯豆的叶绿素含量显著高于丁豆。且同种野生大豆的不同时期叶绿素含量也存在显著差异。丁豆营养期与盛花期差异不显著，结荚期显著高于营养期，盛花期和结荚期差异不显著；凯豆的营养期与盛花期、结荚期差异显著，但盛花期和结荚期无显著差异且显著高于营养期。

图1 两种野生大豆叶绿素含量比较

2.2 光合速率日变化

由图2可知，丁豆结荚期呈先上升后下降的趋势，营养期和盛花期呈下降趋势。凯豆营养期、盛花期、结荚期光合速率均呈先上升后下降的趋势，凯豆3个时期光合速率在10:00时出现峰值，丁豆营养期光合速率在10:00时出现峰值。两种野生大豆在同一时间的光合速率差异显著。在早上8:00时，丁豆营养期与盛花期无显著差异，营养期和盛花期与结荚期差异显著，营养期>结荚期，凯豆结荚期、营养期、盛花期的光合速率间差异显著，结荚期>盛花期>营养期，且凯豆光合速率显著高于丁豆光合速率。当10:00时，凯豆光合速率显著高于丁豆光合速率，凯豆营养期与结荚期差异显著，且结荚期>营养期，营养期与盛花期差异不显著，盛花期与结荚期差异不显著。丁豆3个时期间差异不显著。当12:00时，凯豆的3个时期光合速率显著高于丁豆的光合速率，丁豆的盛花期显著高于营养期和结荚期。当14:00时，凯豆3个时期差异显著，丁豆盛花期高于营养期和结荚期。在16:00时，凯豆和丁豆的盛花期与结荚期差异不显著，但两者与营养期差异显著。在18:00时，丁豆的盛花期与结荚期差异不显著，两个时期与营养期差异显著。凯豆的3个时期间均存在显著差异，且盛花期>结荚期>营养期。

图2 两种野生大豆光合速率比较

2.3 气孔导度日变化

由图3可知，凯豆结荚期气孔导度呈下降趋势，营养期和盛花期呈单峰曲线，在10:00时出现峰值。丁豆的营养期气孔导度呈下降趋势，盛花期和结荚期呈单峰曲线，在10:00时盛花期出现峰值，在12:00时结荚期出现峰值。在8:00—18:00时，凯豆结荚期显著高于盛花期和营养期，气孔导度大小为结荚期>盛花期>营养期。在8:00时，凯豆结荚期显著高于营养期和盛花期，同时也显著高于丁豆3个时期，丁豆营养期显著高于盛花期和结荚期。在10:00时，凯豆3个时期存在显著差异，结荚期>盛花期>营养期，丁豆3个时期差异不显著，凯豆3个时期均显著高于丁豆。在12:00—14:00时，凯豆3个时期差异显著，结荚期>盛花期>营养期，丁豆结荚期显著高于营养期和盛花期，营养期和盛花期差异不显著，其中，凯豆盛花期和结荚期显著高于丁豆结荚期和盛花期。在18:00时，凯豆结荚期显著高于营养期和盛花期。

图3 两种野生大豆气孔导度比较

2.4 胞间CO2浓度日变化

由图4可知，凯豆结荚期的胞间CO2浓度呈下降趋势，营养期和盛花期的胞间CO2浓度呈先下降后上升的趋势。丁豆营养期呈先下降后上升再下降的趋势，其盛花期呈下降趋势，结荚期呈双峰曲线。同时，在8:00时，凯豆3个时期均大于丁豆3个时期，两种野生大豆胞间CO2浓度均为营养期>盛花期>结荚期。在10:00时，凯豆盛花期和结荚期均大于丁豆盛花期和结荚期；凯豆胞间CO2浓度差异显著，结荚期>盛花期>营养期；丁豆营养期和结荚期差异不显著，营养期和结荚期显著高于盛花期。在12:00时，凯豆盛花期和结荚期均大于丁豆盛花期和结荚期，其结荚期显著高于营养期和盛花期，丁豆胞间CO2浓度为营养期>结荚期>盛花期。在14:00时，凯豆3个时期的胞间CO2浓度均大于丁豆3个时期，其大小为营养期>结荚期>盛花期，丁豆大小为营养期>盛花期>结荚期。在16:00时，丁豆大小为营养期>盛花期>结荚期，凯豆营养期和盛花期显著高于结荚期。在18:00时，凯豆营养期显著高于盛花期和结荚期，丁豆大小为营养期>结荚期>盛花期。

图4 两种野生大豆胞间CO2浓度比较

2.5 蒸腾速率日变化

由图5可知，两种野生大豆蒸腾速率均呈先上升后下降的趋势，凯豆盛花期和结荚期在14:00时达到峰值，营养期在12:00时出现峰值。在12:00时丁豆营养期和盛花期蒸腾速率最高，在14:00时结荚期蒸腾速率最大。在8:00时，丁豆结荚期显著高于凯豆，丁豆结荚期显著高于营养期和盛花期，凯豆盛花期>结荚期>营养期。在10:00时，丁豆盛花期显著低于凯豆，凯豆大小为结荚期>盛花期>营养期，丁豆结荚期显著高于营养期和盛花期。在12:00时，凯豆盛花期显著高于丁豆盛花期，其盛花期和结荚期显著高于营养期，丁豆结荚期>盛花期>营养期。在14:00时，凯豆3个时期显著高于丁豆3个时期，两种野生大豆蒸腾速率均为结荚期>盛花期>营养期。在16:00时，两种野生大豆蒸腾速率均为盛花期>结荚期>营养期。在18:00时，丁豆大小为盛花期>结荚期>营养期，凯豆结荚期显著高于营养期和盛花期。

图5 两种野生大豆蒸腾速率比较

2.6 光响应曲线

从表1可知，丁豆营养期在0～ 1200 μmol/(m2·s)范围内的光合速率呈上升趋势，在1200～ 2000 μmol/(m2·s)呈下降趋势；丁豆盛花期和结荚期在0～ 1600 μmol/(m2·s)范围内的光合速率呈上升趋势，在1600～ 2000μmol/(m2·s)范围内呈下降趋势。在0～ 100 μmol/(m2·s)范围内的光合速率为营养期>结荚期>盛花期。凯豆的光合速率随着光照强度的变化而变化，光照强度越强，光合速率越大，但随着光照强度的增大，光合速率受到抑制，开始呈下降趋势。光照强度在 2000 μmol/(m2·s)，营养期、盛花期、结荚期的光合速率均小于1600 μmol/(m2·s)时的光合速率。

表1 两种野生大豆光响应曲线比较

由图6a可知，丁豆光合速率为盛花期>结荚期>营养期，在光照强度为 1600 μmol/(m2·s)均有光抑制现象。由图6b可知，凯豆光合速率大小盛花期>结荚期>营养期。营养期、盛花期、结荚期的光合速率均呈上升趋势，但在光照强度为2000 μmol/(m2·s)时，3个时期的光合速率均小于光照强度为1600 μmol/(m2·s)的光合速率。

将两种野生大豆的营养期、盛花期、结荚期3个时期进行DPS数据拟合，并计算其光补偿点(LCP)、光饱和点(LSP)、最大净光合速率(Pmax)。通过DPS 7.05拟合得出相应的拟合值及参数，将对应的拟合值作图及拟合出的参数分别带入式(2)、(3)、(4)计算出LCP、LSP、Pmax结果如表2所示。

表2 营养期、盛花期及结荚期的LCP、LSP、Pmax、Rd

结合图6和表3可知，当光照强度大于光饱和点时的光照强度时，野生大豆受到光抑制现象；当光照强度小于光补偿点时，野生大豆无法正常光合作用，只能进行暗呼吸。凯豆LCP、LSP、Pmax均为盛花期>结荚期>营养期。丁豆Rd为结荚期>营养期>盛花期，凯豆Rd为结荚期>盛花期>营养期；丁豆LCP为结荚期>盛花期>营养期，LSP和Pmax为盛花期>结荚期>营养期。

图6 丁豆(a)及凯豆(b)光响应拟合修正的直角双曲线模型

通过对野生大豆染色体中期分裂细胞的仔细筛选，挑选出染色体分散情况良好、染色体的数目完整、形态清晰的高质量染色体照片，且对所得到的染色体进行测量及分析，从而得到染色体的相关参数表（表3），根据染色体参数（染色体数、臂比值、不对称系数）可得出野生种的类型。其相关参数内容包括染色体数，染色体臂比，类型，及染色体形态图（图7）。兙俥

根据染色体不同形态图（图7）及染色体核型参数表3可得出，野生大豆的染色体数目都为2n=2x=40，从染色体数目、臂比、不对称系数、最长染色体/最短染色体进行分析得出2个野生种的核型公式2n=22m+16sm+2st，2n=24m+12sm+4st，丁豆和凯豆的核型参数存在差异，其不对称系数分别为61.93%、64.31%，两种野生大豆共有24条染色体为中部着丝粒染色体，14条为近中部着丝粒染色体，2条为端部着丝粒染色体。环境差异越大，不对称系数差异越大，两种野生大豆的不对称系数差异不大，因此，两种大豆的生境条件相近。

表3 野生大豆核型比较

图7 两种野生大豆染色体形态图

3 讨论与结论

野生大豆光合速率日变化呈双峰曲线，存在“光合午休”现象，是野生大豆自身对正午强光和高温等环境因素的适应力，气孔导度和胞间CO2浓度影响植物光合作用和蒸腾作用，两种野生大豆出现午休现象之后，光合速率均呈下降趋势。引起光合午休现象的因素主要有生态因子、生理因子和生化因子[21]，生态因子是外部因素[22]（包括温、光、水、气、肥等的影响），植物本身是受气孔和非气孔因素影响，非气孔因素受叶片自身因素、叶绿素含量、光合酶活性变化的影响[23]，这与吴廷娟[24]的研究结果一致，本研究主要受气孔因素影响，由于野生大豆叶片出现反卷现象，胞间CO2浓度降低，导致光合速率降低。当光强超过光饱和点之后，发生光抑制现象，消耗掉自身制造的有机物。本研究得出，两种野生大豆的光饱和点(LSP)为1067.6232～ 2000.0000 μmol/(m2·s)，光 补 偿 点 (LCP)为 8.5143～ 18.1563 μmol/(m2·s)，两种野生大豆的LSP较高，LCP较低，而阴生植物的LSP在50～ 1000 μmol/(m2·s)，LCP在 20 μmol/(m2·s)[25]，可见，这两种野生大豆是耐阴植物，凯豆的LSP>丁豆，凯豆属高光效植物，丁豆LCP为结荚期>盛花期>营养时期，LSP为盛花期>结荚期>营养时期；凯豆LCP、LSP均为盛花期>结荚期>营养时期。两种野生大豆在盛花期的光合效能最高，有利于有机物积累，Pmax在 7.8613～ 19.2078 μmol/(m2·s)，凯豆的羧化效率较高，光合电子传递活性高，因此对CO2的同化效率高，与LSP的结果一致，光响应曲线拟合的结果均符合修正的直角双曲线模型与索荣臻等[9]研究结果一致。

野生大豆的染色体数目均为2n=2x=40的二倍体这与寿惠霞等[26]结论一致。两种野生大豆不对称系数较大，染色体较不对称这与钟珍萍等[27]研究一致。丁豆核型为2B型，凯豆为2C这与王建波等[28]研究存在差异，可能是不同野生种，同时还受地理环境的影响。需在后续的实验中进行基因鉴定，判断是否与王建波的野生大豆是不同种才能确定产生差异的原因。

叶片光合能力的强弱与叶绿素含量有关[29-30]；植株的叶绿素含量越高，叶片光合能力越强，本研究发现凯豆的叶绿素含量较丁豆高，凯豆的光合速率、气孔导度、胞间CO2、蒸腾速率均高于丁豆，因此光和能力较强，光能利用率高。