不同饵料投喂率对罗非鱼生长、水质和水体微生物群落代谢多样性的影响

东新旭，范立民，宋 超，郑 尧，裘丽萍，孟顺龙，陈家长,

（1南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡214081：2中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡214081）

0 引言

罗非鱼原产于非洲内陆水域，又称为“非洲鲫鱼”，具有适应范围广、生长繁殖快和抗逆性强等特性[1]，能在淡水、咸淡水乃至海水中养殖，成为中国广泛养殖的鱼类产品之一[2]。因此，罗非鱼养殖在中国发展也非常迅速，已成为中国对外出口创汇的主要养殖水产品之一[3]。早在2015年时，联合国粮农组织(FAO)就将罗非鱼定为全球粮食安全和营养的重要保障。但是，随着水产养殖的深入发展，其中存在的生态问题也日益突出，制约了中国水产业的健康发展，在这种背景下，传统的水产养殖业已经不能够很好的满足当前生态环境的发展需求[4]。水产从业者需要从过去的片面追求经济效益，转变为兼顾生态效益。对水产养殖的水域环境管理及养殖水污染治理等方面也提出了更高的要求[5]，并且随着国家对生态环境的重视，对水域的监管力度会持续加大，未来水产养殖中养殖尾水将不能肆意排放，因此，养殖过程中尾水的处理渐渐成为研究热点。

饵料投喂率是影响水产养殖动物生长的重要因素[6]，饵料投喂率过低时，影响罗非鱼的生长性能，基本不生长，饵料投喂率过高时，会降低罗非鱼鱼体免疫力，并且会对肝脏造成一定损伤，出现一定程度的脂肪肝[7]。饵料投喂率过高也容易产生鱼类厌食、摄食能力下降以及破坏水体环境等不利因素[8]，不仅导致了饲料转化效率降低，同时，由于水质污染也会对鱼类的生理机能造成影响。因此，确定鱼类适合的饵料投喂率对鱼类的养殖具有重要意义。目前，关于鱼类最适饵料投喂率已有诸多研究，最适饵料投喂率与水产养殖动物的种类、数量、大小、以及环境因子等很多方面相关。对于特定大小的罗非鱼最适饵料投喂率的研究较少，并且，关于饵料投喂率对微生物群落代谢多样性的研究尚属空白。

微生物在生态系统的物质循环和能量流动中具有重要作用，通过对微生物的数量、代谢活性、群落结构和代谢功能等层面进行研究，可以得到微生物的群落差异和不同环境状况的对应关系[9]。而Biolog-ECO技术通过碳源的利用程度来反应微生物的群体水平，从而反应微生物的生理特征及其群落结构多样性[10-11]。通过对单一种碳源的利用程度，来表示微生物的群体水平，可反应出水体环境中微生物对碳源的利用偏好。本试验研究不同饵料投喂率下，养殖水环境微生物的代谢活性、代谢多样性，探究其对碳源的相对和绝对利用情况，从而能够筛选出有针对性高效降解水体中碳源的降解菌，为水产业的生态发展提供一定的数据支撑，丰富水体微生物学的生态研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020年7—9月开展，试验周期为50天。试验设置5个组，每组各3个平行，每个组分别投喂1%、2%、4%、6%、8%的天邦牌淡水鱼膨化饲料，养殖前，每个1000 L养殖桶中均放入2 kg底泥（采自宜兴罗非鱼养殖池塘）。养殖时，每个养殖桶放养30尾规格接近(16±2 g)的吉富罗非鱼（采自宜兴罗非鱼养殖基地）。养殖期间，各组均不换水，每天早晚进行相同频率的投喂(8:00,14:00)。

1.2 样品采集与处理

在7月27号、8月3号、8月17号、8月24号、9月2号、9月14号采集水面以下30 cm处的水样，水样采集后的高锰酸盐(COD)、总氮(TN)、总磷(TP)、氨氮(NH3-N)、亚硝酸盐(NO2--N)、硝酸盐(NO3--N)等水质指标按照文献[12]所提供的方法进行测定。

在养殖8月17号时，进行水体微生物功能多样性的测定。在无菌条件下，取适量水样用0.85%生理盐水按一定比例稀释，用8孔加样器加到Biolog-ECO微平板中，每孔加样150 μL，28℃恒温培养箱中避光培养，用酶标仪读取培养24、48、72、96、144、168、192 h时Blank590和Blank750波长的数值。孔的平均颜色变化率(Average Well Color Development,AWCD)计算见公式(1)。

式中，C代表每个碳源孔的两波段光密度差值（Blank590和Blank750），R代表对照（空白）孔的光密度值，n为Biolog-ECO微平板上碳源种类数量(n=31)。

1.3 数据统计与分析

罗非鱼饵料系数计算见公式(2)。

微生物群落平均活性即平均颜色变化率(AWCD)，反映了水体微生物群落对碳源的利用能力，以整体数据来分析水体微生物对六大类碳源的利用情况；选取48～ 144 h的数据来分析水体微生物对全部碳源的平均利用差异；选取8月17号的水质指标与培养时间为72 h时微生物对31种碳源利用的光密度值进行相关性分析，选择培养时间为72 h的数据计算水体微生物的香浓(Shannon)指数按照文献[13]；丰富度(Richness)指数的计算按照文献[14]；运用Excel 2019和SPSS 22软件进行数据处理，GraphPad Prism 8进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同饵料投喂率下罗非鱼生长情况和水质指标状况

如表1所示，罗非鱼养殖过程中，投喂不同量的饲料之后，各处理组间罗非鱼增重量和平均体长差异均显著，且8%饲料投喂率组的增重量和平均体长显著高于其他各处理组。饵料系数各组之间差异不显著，4%饲料投喂率组的饵料系数最小。

表1 不同饲料投喂率的罗非鱼生长指标比较

由图1可知，水质指标高锰酸盐、总氮、总磷随饵料投喂率的增加，3种指标在不同饵料投喂率大体都呈现逐渐增加的趋势；氨氮在7月27号时各组之间氨氮差异不显著(P＜0.05)，氨氮在8月17号8%、6%饵料投喂率组显著高于1%、2%、4%组(P＞0.05)，氨氮在8月24号、9月2号各组之间差异不显著，氨氮在9月14号8%饵料投喂率组显著高于其他各组(P＜0.05)，且其他各组之间的氨氮含量差异不显著；水质指标亚硝酸盐氮在8月17号、8月24号8%饵料投喂率组显著高于1%、2%、4%组，亚硝酸盐氮在9月2号8%饵料投喂率组显著高于1%、2%组，但和4%、6%组差异不显著，亚硝酸盐氮在9月14号8%、6%、4%饵料投喂率组显著高于1%组；硝酸盐氮8月24号、9月2号8%饵料投喂率组显著高于其他各组，且其他各组之间硝酸盐氮含量差异不显著，硝酸盐氮在9月14号8%饵料投喂率组显著高于1%、2%组，4%饵料投喂率组与其他各组之间差异均不显著。

图1 不同饵料投喂率下水质指标的变化

2.2 不同饵料投喂率下微生物六大类碳源代谢特征的变化

对聚合糖类、氨基酸类、酯类、醇类、胺类和酸类六大类碳源在不同饵料投喂率下的变化进行分析表明（见图2），水中微生物对酯类碳源的利用值最高，其次为酸类和氨基酸类；并且对酯类的利用值在各组间较为稳定。对聚合糖类和氨基酸类的利用值随投喂量的变化从4%的投喂率开始呈逐渐增加趋势。8%饵料投喂率下水体微生物对六大类碳源的利用普遍较高。8%饵料投喂率下水体微生物对聚合糖类的利用显著高于4%饵料投喂率(P＜0.05)。

图2 不同饵料投喂率微生物六大类碳源代谢变化

从图3中可以看出AWCD随时间的变化情况，在48 h时，8%饵料投喂率下的AWCD显著高于1%、2%、6%饵料投喂率组(P＜0.05)，与4%饵料投喂率下的AWCD不显著(P＞0.05)。在72 h时，8%饵料投喂率下的AWCD显著高于2%饵料投喂率组(P＜0.05)，其他各组之间差异不显著(P＞0.05)。在96 h、120 h、144 h各组之间差异均不显著。不同饵料投喂率下的水体微生物对碳源的利用强度随着培养时间的延长总体上呈现逐渐上升的趋势。

图3 不同饵料投喂率水体微生物平均吸光值(AWCD)变化特征

α多样性分析结果表明（见图4），随着饵料投喂率的增加(2%～ 8%)，微生物代谢丰富度指数有所增加，香浓指数则下降，特别是6%和8%的饵料投喂率香浓指数显著低于2%和4%饵料投喂率(P＜0.05)，表明在高饵料投喂率下水中以代谢多样性作为分类依据的主要异养菌种类呈增加趋势，但优势异养菌的类别在减少，呈现集中的趋势。

图4 不同饵料投喂率下水中微生物代谢多样性指数

2.3 不同饵料投喂率下水体微生物对31种碳源代谢利用(AWCD)的变化

水体微生物代谢31种碳源的利用情况分析结果（图5）表明，β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、肝糖、D-纤维二糖、L-天冬酰胺酸、吐温80、吐温40、丙酮酸甲酯、D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄胺、4-羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸依次为主要的碳源代谢类型。其中，虽然微生物对吐温80、丙酮酸甲酯、γ-羟基丁酸的利用值尽管较强，但是随着饵料投喂率的增加呈现较为稳定的状态，并没有显著增加；水体微生物对L-天冬酰胺酸、D-甘露醇的利用值在1%～ 4%饵料投喂率呈逐渐增加的趋势。4%～ 8%饵料投喂率水体微生物对β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、肝糖、D-纤维二糖、吐温40、N-乙酰基-D-葡萄胺等碳源的利用值亦呈现增加的趋势。1%～ 8%饵料投喂率水体微生物完全未利用的碳源有2-羟基苯甲酸。

图5 不同饵料投喂率间水体微生物对六大类（31种碳源）利用值的变化

微生物对31种碳源的利用值和水质指标间进行Pearson相关性分析结果（见图6）表明，β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、甘氨酰-L-谷氨酸、I-赤藻糖醇等和主要水质指标，尤其是COD、TN、TP、NH3-N间具有显著的正相关关系(P＜0.05)：而肝糖主要与3种水质指标COD、TN、TP具有显著的正相关关系(P＜0.05)；D-半乳糖酸γ内酯与两种水质指标NO2--N、NO3--N具有显著的正相关关系(P＜0.05)，N-乙酰基-D-葡萄胺与TN、NH3-N间具有很强的正相关关系(P＜0.05)；D-氨基葡萄糖酸仅与NO2--N具有显著的的正相关关系(P＜0.05)，L-苯基丙氨酸、D-甘露醇仅与NO3--N呈现显著的正相关性(P＜0.05)。苯乙基胺、腐胺、2-羟基苯甲酸这3种碳源的利用与水质指标都呈现负相关关系。

图6 微生物对31种碳源利用值与水质指标间Pearson相关性分析

3 讨论

3.1 不同饵料投喂率对罗非鱼生长效应和水体理化指标的影响

在本试验中，高饵料投喂率在一定程度上提高了罗非鱼(16±0.20 g)的生长水平，但是也提高了饵料系数，降低了饵料的利用效率；低饵料投喂率使罗非鱼由于摄食不足而限制了其生长，但是饵料系数没有降低，饵料利用率也没有提高，这与周晴[15]研究结果低饵料投喂率降低了饵料系数，提高了饵料利用效率不相同，造成这种差异的因素可能与水体环境因子、微生物的种类数量等有关系。而4%饵料投喂率饵料系数最小，饵料的利用程度最高，有利于节约“饲料能源”。在本试验中8%饵料投喂率的平均增重量和平均体长都要好于其他各组，但饵料系数较高，8%饵料投喂率对于水体环境的破坏也最为严重，后续对于养殖尾水的处理也会有较大的投入，这种情况下，综合平衡生态效益与经济效益4%饵料投喂率更具有优势。

研究不同饵料投喂率下养殖水体的水质变化特性，对于水产养殖业的健康发展具有重要作用。COD、TN、TP随饵料投喂率的增加大体也呈现一个增加的趋势，这反应了饵料投喂率增大对水体水质污染的事实。8月24号、9月2号和9月14号NO2--N、NO3--N随饵料投喂率增加呈现逐渐上升的趋势，而且6%和8%饵料投喂率相比其他组有急剧增加的趋势，尤其是8%饵料投喂率，饵料投喂增多，氮元素在水中蓄积，影响了氮的循环系统，造成这两种水质指标上升。NO2--N和NH3-N对水产养殖动物都有一定的毒性，在本试验中，在8月17号，8%、6%饵料投喂率NH3-N显著高于其他各组，主要是由于饲料投喂过多导致的NH3-N含量增加，而且水体微生物和藻类的数量少，来不及反应和分解水中的氮元素。8月24、9月2号各组之间氨氮含量差异均不显著，可能的原因一方面，在夏季高温时节罗非鱼生长较快，高饵料投喂率罗非鱼生长到一定程度，固氮作用要高于低饵料投喂率组，另一方面，高饵料投喂率组由于残饵和罗非鱼排泄物，导致水体中微生物和藻类的数量较多，也可以起到固氮和消耗氮素，而低饵料投喂率，饵料投喂少，水中微生物和藻类数量也少，对饵料和罗非鱼排泄物的固氮和消耗氮素能力较低，综合多方面的因素，产生了饵料投喂率较高但和低饵料投喂率氨氮含量差异不明显的结果。9月14号，8%饵料投喂率氨氮含量明显高于其他各组，原因是由于此时温度开始下降，罗非鱼的生长也已经达到一定的限度，固氮作用下降，微生物和藻类繁殖能力和活性也开始下降。

3.2 不同饵料投喂率对六大类碳源代谢和AWCD的影响

在池塘养殖的水体中含有大量的养殖过程中的剩余溶解的营养物质，而水产动物对蛋白质、糖类、酯类三大类营养物质的利用率通常为蛋白质最高，其次为糖类，最后是酯类，所以正常情况下看，水体中糖类及油脂类的碳源是相对较高的[16]。杨莺莺等[17]研究则表明在池塘水体环境中微生物群落利用较高的碳源类型为氨基酸类、酸类和糖类。曹煜成等[18]在罗非鱼养殖池塘中水体微生物对碳源代谢的研究发现糖类的利用强度最高，酯类、氨基酸类次之，最低是次生代谢产物类。在本试验中，不同处理下的水体微生物均表现为对酯类碳源的利用最高。而1%饵料投喂率水体微生物对酸类利用排第二，其次为氨基酸类碳源；2%～ 8%饵料投喂率水体微生物碳源利用排第二的是氨基酸类碳源，排第三的碳源利用2%～ 8%饵料投喂率各不相同，这与杨莺莺、曹煜成、史磊磊所描述的部分相同。由于饵料投喂率逐渐增大，导致水体微生物对六大类碳源代谢利用各组之间相比有些许差异。但是可以说明的是不管高饵料投喂率还是低饵料投喂率罗非鱼对油酯类的利用都较低，并且水体微生物对氨基酸类代谢活性从4%～ 8%呈逐渐增加趋势，说明较高的饵料投喂率，导致水体中的蛋白质含量增加，水体微生物中利用氨基酸类碳源的微生物增多。随着饵料投喂率的增大，水体中营养物质的差异改变了水体微生物群落的结构，造成对不同碳源的利用程度上存在着差异。

AWCD随着时间的变化可以用来反映微生物碳源代谢利用情况，能直观的表达水体微生物群落代谢活性和最终到达程度，它提供了在相同碳源下不同微生物对碳源利用相比较的可能性[19]。不同饵料投喂率的AWCD随培养时间呈现逐渐增加的趋势，对比不同处理组的水体微生物碳源代利用强弱可以明显看出48～ 96 h 8%饵料投喂率的水体微生物代谢利用明显高于其他各组，由于营养物质是微生物代谢的基础[20]，在高饵料投喂率下，剩余的饵料、生物代谢产物、生物残体等有机物含量较高，丰富的营养物质使微生物的分解代谢活跃。香浓指数、丰富度指数分别反映水体微生物的多样性和丰富度[21]，在72 h时，随着饵料投喂率的增加，水体微生物多样性有显著变化，6%和8%饵料投喂率低于2%和4%饵料投喂率，丰富度大致呈现逐渐增加的趋势，说明不同饵料投喂率对水环境中的微生物多样性有显著影响，2%和4%饵料投喂率的香浓指数较大，水体中的微生物种类较多，而8%饵料投喂率的微生物丰富度较高，水体中微生物的数量较多，但微生物种类数较少，并且这种趋势会随着投喂时间的延长而逐渐加剧。而在120～ 168 h 8%饵料投喂率的微生物碳源代谢活性开始下降，4%、6%饵料投喂率水体微生物碳源代谢活性开始逐渐接近和超过8%饵料投喂率的微生物碳源代谢活性，则表明8%饵料投喂率对微生物碳源代谢活性起到了抑制作用，原因是由于8%饵料投喂率的优势单一菌的数量较多，种类并不丰富，对碳源利用种类较少，在这种情况下往往会导致养殖水体条件恶化。

3.3 不同饵料投喂率对31种碳源的代谢特征的影响

在池塘养殖水体中微生物群落对Biolog-ECO板上31种碳源的选择及利用程度，可以间接的反映出水体微生物对不同种类碳源的代谢偏好，进而更好的了解水体微生物群落的分解代谢特征[22]。在水体微生物群落代谢利用较高的碳源中，1%～ 4%饵料投喂率下水体微生物对L-天冬酰胺酸、D-甘露醇的利用值呈逐渐增加的趋势，水体中蛋白质的分解会产生L-天冬酰胺酸，进一步被微生物利用，由于1%、2%饵料投喂率下饵料供给率低，罗非鱼进食不均，导致鱼体差异较大，鱼类也长期处于饥饿状态，机体的正常发育受到限制[23]，在这种情况下也会导致饲料的浪费，进而导致水体中利用L-天冬酰胺酸的微生物增多，表现为对此类碳源的利用值提高。D-甘露醇是一种糖醇，广泛存在于植物和藻类等生物体内[24]，水体微生物对D-甘露醇代谢活性较高，可能是由于水体中产生D-甘露醇的藻类处于优势地位导致的。随着饵料投喂率从4%增加到8%，水体微生物对β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、肝糖、D-纤维二糖、吐温40、N-乙酰基-D-葡萄胺等的利用率提高，并且AWCD值也较高，其中葡萄糖-1-磷酸盐是羟基被磷酸替代的活化的葡萄糖，糖原、蔗糖合成的中间体，乳糖发酵的中间体，参与糖酵解和糖异生的过程[25]，水体微生物对葡萄糖-1-磷酸盐代谢活性高，说明高饵料投喂率的水体中葡萄糖的发酵作用较强，能够表明罗非鱼摄食过程中剩有过多的残饵，可能与水体中的酵母菌发酵分解有机质造成此类碳源在水体中含量过高有关[26]；土温40是被用来了解脂类微生物选择培养基的原料之一[27]，随饵料投喂率增加水体微生物对此类碳源的利用率有一定提高，但差异不明显。N-乙酰基-D-葡萄胺在胺类碳源中的利用率较高，并且从2%～ 8%饵料投喂率增加代谢活性逐渐增强，而N-乙酰基-D-葡萄胺具有组成几丁质、粘多糖、糖蛋白的单体之一的特性，同时也是细菌和大多数真菌的细胞壁组成成分[28]，是水体细菌生长的必要条件之一，高饵料投喂率水体中微生物对其利用率的提高，可反映出水体中有大量微生物繁殖。31种碳源中不利用的碳源(AWCD＜0.1)有2-羟基苯甲酸（又名水杨酸），这与Li等[29]研究发现在杂交鳢和大口黑鲈高产池塘养殖水体中微生物对2-羟基苯甲酸也未利用，与本试验研究结果一致，说明不论是高饵料投喂率还是低饵料投喂率水体微生物都不能够利用2-羟基苯甲酸，进一步验证了在池塘养殖系统中是不存在能够利用2-羟基苯甲酸的微生物。由于水产养殖过程中，投喂或管理不到位，导致饵料得不到充分的利用，往往容易形成严重的水污染问题[30]。因此，在不同饵料投喂率尤其是高饵料投喂率下分析水体微生物对31种碳源的代谢特征利用率，可以作为筛选有针对性高效降解水体中碳源类物质的重要参考，为健康养殖和微生物原位修复技术提供依据。

不同饵料投喂率水体微生物对糖类代谢差异的原因与水体环境因子有着紧密的联系，田相利等[31]研究发现水体中微生物群落对碳源利用是存在选择性偏好，并且这种偏好随养殖时间和环境因子的变化而发生变化。图6中微生物对31种碳源利用值与水质指标间相关性分析表明，水质环境因子对水体微生物代谢31种碳源具有重要作用，COD、TN、TP、NH3-N对水体微生物代谢β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、甘氨酰-L-谷氨酸具有很强的正相关关系，这3种糖类在4%～ 8%饵料投喂率下水体微生物代谢利用值呈上升的趋势，分析其中原因，COD高低表征的是水体有机营养成分含量多少[32]，水产动物的排泄和高饵料投喂率残饵会造成水中N、P元素大量积累，进而导致水中TN、TP含量上升，同时COD也会上升，结合图1看趋势大致是相同的，但NH3-N、NO2--N、NO3--N变化趋势却有所不同，这主要是由于它们在水中的变化较为复杂，NH3-N在水体中存在2种形式离子氨、非离子氨，并且两者可以在水体中相互转换[33]，NO2--N的硝化过程，NO3--N反硝化过程。N、P也是组成微生物细胞的主要元素，微生物代谢这些糖类物质，势必也会对水中N、P需求有所增加，因而COD、TN、TP、NH3-N表现为对微生物代谢3种糖类物质起促进作用。综合来看，不同处理的饵料投喂率对整个养殖系统的微生物群落的组成产生了较大的影响。因此，通过调控饵料投喂率，进而调节养殖水体的水质，使水产养殖向健康养殖道路发展。

4 结论

对于养殖水质调控来讲，饵料投喂率超过6%可能造成水质的急剧变化，4%饵料投喂率饵料系数较低，水质指标NH3-N变化幅度较小；4%饵料投喂率养殖水环境更有利于罗非鱼的生长；饵料投喂率从4%增加到8%，水体微生物对β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、肝糖、D-纤维二糖、吐温40、N-乙酰基-D-葡萄胺等的利用率提高，其中β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸盐、甘氨酰-L-谷氨酸等与主要水质指标，尤其是COD、TN、TP、NH3-N间具有较强的正相关关系。