制片方法对枣花授粉荧光显微观察效果的影响

陈 娟，王 森，邵凤侠

（中南林业科技大学 a.经济林培育与保护教育部重点实验室；b.经济林育种与栽培国家林业和草原局重点实验室；c.湖南省南方丘陵山地生态经济林产业工程技术研究中心，湖南 长沙 410004）

中秋酥脆枣Ziziphus jujubacv.Zhongqiusucui为鼠李科Rhamnaceae 枣属Ziziphus植物[1]，是湖南省选育出来的一个高档鲜食枣品种，具有果实大、甜度高的特点[2-3]。枣花为两性完全花，呈黄绿色，具萼片、花瓣、雄蕊各5 枚。雌蕊着生蜜盘中央，柱头二裂，稀三裂，短壮丰满，呈圆锥体形，花朵盛开时先端分开[4]。枣树花量大，花期长，自然情况下坐果率很低[5]。

常用的植物制片技术有石蜡制片法、压片法、冰冻切片法、半薄切片法及超薄切片法等，观察技术有荧光显微术、扫描电镜术以及透射电镜术等[6]。枣花花柱组织较硬，细胞组织较厚，用常规压片法在光学显微镜下观察枣树花粉管的生长，效果不理想，只能观察到柱头表面花粉管的萌发，看不到柱头内部的生长过程。为使组织能被压成薄层，以利在显微镜下检查花粉管，在染色前常需要对材料进行软化。水煮和NaOH 溶液浸泡是常见的植物材料软化方式[7]。热水煮可以溶解掉植物材料内部的无机盐、糖、植物碱、单宁、色素、淀粉、果胶质、多乳糖等多种成分；NaOH 和KOH 等强碱溶液除了能溶解上述成份外，还能溶解部分木质素、戊聚糖、糖醛酸等。

成熟的花粉粒具有两层细胞壁，即花粉内壁和花粉外壁。花粉内壁的化学组成为果胶质和胼胝质，结构较薄，而外壁的组成成分为纤维素、角质和孢粉素，结构较厚[8-9]。研究花粉管最常用的荧光染料为水溶性苯胺蓝，可与花粉管的胼胝质特异性结合，在宽带紫外光激发下产生强烈荧光，而花柱和子房组织的自发弱荧光则颜色较暗，两者反差明显，很容易区分，便于确定花粉管在花柱中的位置[6,10]。

枣树普遍坐果率低，胚败育现象严重，极大地制约了枣树杂交育种进程[3,11]。这些问题与受精过程密切相关，因此研究枣树花粉管生长显得尤为重要。有关植物花粉管生长的荧光观察的研究比较多。胡适宜[12]简要介绍了供荧光显微镜下检查花粉管的制片法；张学英等[13]、王尧等[14]利用荧光显微镜研究了枣树授粉受精过程、柱头可授性以及花粉管生长。Asatryan 等[15]利用苯胺蓝对枣花进行染色拍照，在黑暗背景的反衬之下能明显看到花粉管在花柱内呈现的蓝绿色荧光。以上研究均采用NaOH 溶液对材料软化，苯胺蓝染色，在荧光显微镜下观察花粉管，但其观察效果并不是非常理想。本研究采用荧光显微技术，通过比较不同处理下枣花花粉管的荧光观察效果，确定适合观察枣花花粉管的制片方法。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验地为湖南省衡阳市祁东县风石堰镇中南林业科技大学枣树试验基地。

试验树为4年生中秋酥脆枣健康植株，从其生长发育良好的枣吊上采摘不同开放阶段的枣花作为试验材料，用FAA（福尔马林-乙酸-50%酒精混合液）固定液固定保存。

1.2 方 法

1.2.1 不同软化方法处理对枣花花柱软化效果的影响

本试验采用NaOH 溶液对枣花进行软化，设置了不同浓度的NaOH 溶液和处理时间（表1）。将枣花从固定液中取出，依次在50%和30%乙醇溶液中浸泡各30 min 后，用蒸馏水冲洗数次，然后进行软化处理。以相同时间用蒸馏水浸泡的枣花作为对照，比较不同软化方法对枣花花柱的软化效果，并用OLYMPUS SZ51 体视显微镜观察拍照。每个处理重复3 次，每处理枣花数不少于10 个。

表1 软化方法试验设计Table 1 The experimental design of softening method

1.2.2 不同染色方法处理对枣花花粉管观察效果的影响

将经过不同软化方法处理后的枣花取出，蒸馏水冲洗干净后，用水溶性苯胺蓝染液（0.15 mol/L 磷酸盐缓冲液配制，pH 值8.2）对枣花进行避光染色，比较不同染色方法对枣花花粉管荧光观察效果的影响（表2）。每个处理重复3 次，每处理枣花数不少于10 个。

表2 染色方法试验设计Table 2 The experimental design of dyeing method

用荧光染料染色的标本不能长期保存，所以应及时制片观察。枣花染色完全后，将其取出，用吸水纸吸去多余水分。用刀片纵向剖取花柱及子房部分，置于载玻片上，用玻棒蘸取少许甘油滴于花柱上，盖上盖玻片，并用镊子稍加压力，使花柱展开。用OLYMPUS BX51 荧光显微镜观察并拍照记录[16]。

2 结果与分析

2.1 不同软化方法处理对枣花花柱软化效果的影响

枣花经不同软化方法处理后，用蒸馏水冲洗干净，在体视镜下直接镜检，拍照后进行后续染色处理和压片观察。

由表3、图1可知，经蒸馏水浸泡0.5 h 的枣花，花柱组织呈浅黄色（图1A），用刀片剖取花柱时，花柱组织完整，但压片时材料不平整；延长浸泡时间，枣花花柱外观变化不明显（图1G）。经1、2 mol/L NaOH 溶液处理0.5、1 h 的枣花，花柱和柱头的颜色加深，花柱组织基本完整，压片也较平整，组织软化效果较好（图1B—C，H—I）。经3 mol/L NaOH 溶液处理0.5 h 后，枣花柱组织呈黑色（图1D），剖取花柱时组织较完整、压片平整；经3 mol/L NaOH 溶液处理1 h 后，剖取花柱时组织易碎，压片平整（图1J）。经4、8 mol/L NaOH 溶液处理的枣花花柱组织松软，用刀片剖取花柱以及用镊子轻压盖玻片时组织易碎（图1E—F）；随着处理时间的延长，枣花颜色明显变深，用刀片剖取花柱时组织软化程度也明显加深（图1K—L）。

图1 不同浓度NaOH 溶液处理后的枣花效果Fig.1 The effect picture of jujube flowers after different concentration NaOH softening

表3 不同软化方法对枣花花柱压片效果的影响Table 3 The effect of different softening methods on jujube flowers tableting

相同的软化时间，NaOH 溶液浓度越高，枣花软化程度也越高，压片时枣花也越容易压平，但NaOH 溶液浓度超过4 mol/L 后，枣花组织明显变松软，过度软化，压片时组织也容易破碎而不便观察。NaOH 溶液浓度越高，所需软化处理时间越短；而使用低浓度NaOH 溶液处理软化效果较差，且需要较长处理时间。选择1、2 和3 mol/L NaOH 溶液对枣花进行软化，都能取得良好的压片效果。

2.2 不同染色方法处理对枣花花粉管观察效果的影响

相同软化处理条件下，通过比较枣花在相同处理时间下不同浓度水溶性苯胺蓝溶液的染色效果，以及同一浓度水溶性苯胺蓝溶液染色不同时间的效果，探究适合观察枣花粉管萌发的染色方法。

在不软化的条件下，枣花经0.01%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，能观察到花柱细胞呈现微弱的荧花，且与暗色背景对比不明显，而花粉管形态清晰可见，呈现出明亮的蓝绿色荧光（图2A）；经0.05%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，花柱与背景的颜色对比明显，组织结构完整，花柱表面花粉粒可见，但无法观察到花粉管（图2B）；经0.1%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，可以观察到柱头表面有少量花粉粒，花柱细胞现呈现蓝色荧光，花粉粒与花柱其他部分显色对比不明显（图2C）。枣花经3 种浓度水溶性苯胺蓝溶液染色1 h，图片较难分辨花柱与背景的交界，但均能观察到花粉和花粉管产生的强烈荧光（图2D—F）。经3 种浓度水溶性苯胺蓝溶液染色4 h，可观察到枣花花柱与背景颜色对比较明显，花粉管发出强烈的蓝绿色荧光，但与花柱相比花粉管分辨度不高（图2G—I）。

图2 不经NaOH 溶液软化时不同浓度水溶性苯胺蓝溶液染色效果Fig.2 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing without softening

在1 mol/L NaOH 溶液软化0.5 h 的条件下，枣花经0.01%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，能观察到花柱产生的荧光较弱，这可能是花柱着色不充分或者染色时间较短的缘故（图3A）；经0.05%水溶性苯胺蓝染色0.5 h，可清晰观察到枣花柱头表面的花粉管（图3B）；经0.1%水溶性苯胺蓝染色0.5 h，花柱细胞与暗色背景对比不明显，可以观察到柱头表面有少量花粉粒和花粉管（图3C）。染色时间为1、4 h 时，3 种浓度染色的枣花花柱在周围暗背景的反衬下，均能观察到强烈的蓝绿色荧光，都能清晰地观察到花粉管结构，且花柱细胞与花粉管颜色对比明显（图3D—F，G—I）。

图3 1 mol/L NaOH 溶液软化0.5 h 不同浓度水溶性苯胺蓝溶液染色效果Fig.3 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing after 1 mol/L NaOH softening 0.5 h

在2 mol/L NaOH 溶液软化0.5 h 的条件下，枣花经0.01%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，花柱与背景的颜色对比明显，但没有观察到花粉粒和花粉管（图4A），这可能是因为枣花所处开放阶段较早，花粉未成熟或没有进行授粉；经0.05%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，在柱头上能观察到花柱表面的蓝绿色荧光颗粒以及花粉管发出的明亮荧光，可见花柱表面花粉粒及花粉在柱头上的萌发情况，但在花柱中只观察到部分花粉管萌发（图4B）；经0.1%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，只见有花粉管的点状荧光，未观察到完整的花粉管（图4C）。染色1、4 h 时，枣花花柱经过3种浓度水溶性苯胺蓝溶液染色后，均能观察到花粉粒发出的强烈荧光，与图片背景对比明显（图4D—F，G—I）。

图4 2 mol/L NaOH 溶液软化0.5 h 不同浓度水溶性苯胺蓝溶液染色效果Fig.4 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing after 2 mol/L NaOH softening 0.5 h

在3 mol/L NaOH 溶液软化0.5 h 的条件下，枣花经0.01%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，花柱与背景的颜色对比明显，花柱表面观察到少量花粉粒（图5A）；经0.05%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，在柱头上能观察到明亮的蓝绿色荧光区域，柱头表面能观察到少量的花粉管（图5B）；经0.1%水溶性苯胺蓝溶液染色0.5 h，未观察到完整的花粉管，只见有点状的花粉管荧光（图5C）。染色1 h（图5D—F）和4 h（图5G—I），经过3 种浓度水溶性苯胺蓝溶液染色的枣花花柱上，均能观察到花粉发出的强烈荧光，与背景对比十分明显。

图5 3 mol/L NaOH 溶液软化0.5 h 不同浓度水溶性苯胺蓝溶液染色效果Fig.5 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing after 3 mol/L NaOH softening 0.5 h

综合以上分析，经1、2 和3 mol/L NaOH 溶液软化处理后，对枣花进行染色观察发现，枣花花柱与图片背景对比明显，清晰可见花粉粒和花粉管产生的蓝绿色荧光。在相同软化方法处理的条件下，随着相同浓度水溶性苯胺蓝溶液染色时间的增加，对花粉管的染色效果并没有产生明显的增强作用。而相同染色时间内，用高浓度的水溶性苯胺蓝溶液对枣花进行染色，染色效果比低浓度的好。

3 讨 论

对荧光显微结果进行分析发现，花粉管在很大程度上依然被花柱组织遮挡，花粉管观察效果不理想。这可能是枣花柱组织过厚、透明效果较差，导致花粉管生长被花柱组织遮挡。本研究仅进行了染色前的软化方法对压片效果的试验，对软化过程中枣花花柱的透明效果未进行探讨。如何对花柱进行透明并在软化过程中兼顾透明效果或者采用更多形式的软化方式，如使用透明剂、水煮等方法[17-18]，可以成为下一步研究的方向。实验中常用的3 种透明剂，即强碱（NaOH 或KOH）、冬青油和甘油对不同植物材料进行处理，都取得了良好的效果[18]。程云清等[17]对木质化的榛子花柱进行NaOH 溶液浸泡并水煮20 min 处理后，花粉管结构更清晰，软化效果更好。吴军等[19]研究发现使用2 mol/L NaOH 溶液对麻疯树雌蕊组织进行透明处理比较适宜。侯思皓等[20]、任海燕等[21]使用2 mol/L NaOH 溶液浸泡并水煮枣花花柱30 min，使花柱组织得到了最大程度的透明化处理，花粉管荧光显微效果较好，排除了花柱组织的干扰，可更准确地观察花粉管生长进程及判断花粉管生长受抑制的部位。

对试验结果进行分析发现，处在萼片展平期前期的枣花，经水溶性苯胺蓝溶液染色后在荧光显微镜下拍照，仅能观察到少量的花粉和花粉管出现。中秋酥脆枣枣花柱头在未展开时已具可授性，蕾扁期至萼片展平期柱头可授性由弱增强，枣花柱头可授性最强时为萼片展平期至花瓣展平期[22]。选择处在花瓣展平期和雄蕊下垂期的枣花，通常能清晰地观察到花粉在柱头表面萌发以及伸入花柱道。受精成功是多数果树获得较高坐果率及产量的必要条件，但前提是花粉管能够在花柱中顺利生长并穿过花柱在胚丧失活力之前到达胚珠[23]。研究发现，萌发的枣花粉管大多集中在柱头附近或者向下伸至花柱1/3 处，少部分花粉管或横向生长，或向上生长，或扭曲、盘旋，未见有正常伸入花柱道1/2 处或进入子房的情况。花粉粒多数能在柱头表面萌发，大部分能进入柱头继续生长，在花柱道内生长过程中，有的逐渐停止生长，因此在实验中只能观察到少数花粉管到达子房。这可能是由于枣树存在自交不亲和现象，柱头表面细胞产生胼胝质，阻止花粉管延伸进入花柱，或者生长的花粉管顶端产生大量胼胝质，形成胼胝质塞从而抑制了花粉管向下生长[8,14]。

4 结 论

1）选择1、2 mol/L NaOH 溶液处理枣花花柱，都能取得良好的制片效果。在相同处理时间下，NaOH 溶液浓度越高，枣花软化程度也越高；而NaOH 溶液浓度越高，所需软化处理时间越短。

2）在软化时间的选择上，软化0.5 h 就能取得较好的压片效果，这能缩短试验需要的时间。在相同软化方法处理的条件下，同一浓度水溶性苯胺蓝溶液的染色时间增加，对花粉管的染色效果并没有产生明显的增强作用；而相同染色时间下，用高浓度的水溶性苯胺蓝溶液对枣花进行染色，染色效果比低浓度的好。