韩卫娟,傅建敏,王丽媛,王艺儒,刁松锋,李华威,孙 鹏,索玉静
(1.国家林业和草原局 泡桐研究开发中心,河南 郑州 450003;2.经济林种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室,河南 郑州 450003)
油柿Diospyros oleiferaCheng为柿科Ebebaceae柿属Diospyros植物,落叶乔木,广泛分布于中国中南部,与某些柿品种嫁接亲和性好,可引起树形矮化,提早结果,是良好的砧木种类[1-2]。油柿又称洞柿、方柿、油柿子,果实成熟期10月底至12月初,果实未成熟时青绿色,单宁含量高,可用于提取柿漆;成熟时暗黄色,有易脱落的软毛,既能鲜食,又可加工,风味独特,且兼有营养与药用价值,开发潜力巨大[3-4]。
油柿作为二倍体(2n=2x=30)植物,是六倍体(2n=6x=90)柿的最近缘种[5-7],在研究柿的起源方面具有重要价值,同时也是重要的育种亲本。相对于二倍体君迁子,油柿的性别类型、果实发育特征等更相似于六倍体柿,所以目前已成为研究柿性别决定、果实大小、果实单宁合成等重要性状的参考树种。目前,已有报道的油柿相关研究主要集中在嫁接亲和性、植株再生技术以及形态学研究等方面,果实品质特征成分及果实发育过程中生理指标的变化规律等相关研究尚未见文献报道。
单宁、多酚、黄酮、可溶性固形物等是柿属植物果实中最为重要的几种有效成分,对果实的鲜食和加工品质均有重要影响[8]。果胶主要存在于相邻细胞间的胞间层中,起着粘连的作用,与果实质地有密切关系[9];半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)和果胶甲酯酶(PME)参与果胶的降解[10-11];质地变软是果实发育成熟的标志之一,可直接影响果实的食用品质、贮藏性和商品价值。本研究以不同发育时期的油柿果实为试验材料,对成熟软化过程中单宁、黄酮、总酚、果胶含量以及半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)和果胶甲酯酶(PE)活性的变化规律进行研究,并分析其相关性,以期为油柿果实的深入开发利用奠定理论基础,以及为六倍体柿果实品质特征性状的研究提供参考。
油柿果实样品采自中国林业科学院经济林研究开发中心原阳试验基地(112°42′58″E,34°51′38″N),选择树势健壮、无病虫害的无性系单株,从东南西北4 个方向进行样品的采集。在果实成熟期,分别于2019年9月25日、10月24日、11月28日、12月5日和12月13日(果实软熟无涩味)采集油柿果实样品,低温冷藏运回实验室,冰水冲洗后用纱布吸干表面水分,去皮并将果肉切碎经液氮速冻于-80℃超低温冰箱中保存,用于相关指标的测定。
1.2.1 单宁含量的测定
可溶性单宁和不溶性单宁的测定采用Folin-Ciocalteu 法,参考Oshida 等[12]和余轩等[13]的方法,以单宁酸为标准品,725 nm 处测定吸光度,总单宁含量为可溶性单宁含量和不溶性单宁含量之和。
1.2.2 总酚含量的测定
总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu 法[14],以没食子酸为标准品,765 nm 处测定吸光度,样品中总酚含量以没食子酸计。
1.2.3 黄酮含量的测定
黄酮含量的测定采用AlCl3-(HAc-NaAc)方法[14],以芦丁为标准品,400 nm 处测定吸光度,样品中总黄酮含量以芦丁的含量表示。
1.2.4 可溶性糖含量及糖组分含量的测定
可溶性糖含量采用蒽酮比色法[15]测定。
糖组分的提取方法参照杜改改等[16]的方法并稍作改进。精密称取5.000 g 果肉,10 mL 超纯水80℃水浴中震摇提取60 min,冷却后15 000 r/m离心20 min,上清液转入25 mL 的容量瓶中,10 mL超纯水再次提取残渣,合并上清液后用超纯水定容,摇匀后用0.22 μm 微孔滤膜过滤后上机测定。糖组分的检测采用高效液相色谱法,色谱柱为Suger-Pak I 色谱柱6.5 mm×300 mm,柱温为70℃,流动相为超纯水,流速为0.5 mL·min-1,检测器为Waters 410 示差折光检测器。根据峰面积和标准曲线计算果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。
1.2.5 果胶组分含量的测定
参考齐秀东等[17]的方法进行水溶性果胶(WSP)、离子结合果胶(ISP)、共价结合果胶(CSP)的提取,以半乳糖醛酸为标准,用咔唑比色法测定各果胶组分。
1.2.6 果胶降解酶活性的测定
多聚半乳糖醛酸酶(PG)的提取和测定参考Ren 等[18]的方法并加以改进。PG 活性以每分钟每克果肉在37℃催化半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的质量表示,单位为mg·g-1h-1;果胶裂解酶(PL)的提取和测定参考Zhi 等[19]的方法并加以改进,PL 活性被定义为每分钟作用果胶产生1 μmol 双键所需的酶量,单位为U·g-1;果胶甲酯酶(PE)的提取和测定参考Guo 等[20]的方法并加以改进,PE活性被定义为每克果肉每分钟吸光度值的变化,单位为ΔOD·g-1min-1。
利用Excel 2019 软件计算平均值、标准偏差、线性回归方程等指标;利用SPSS 20.0 软件进行方差分析、Duncan 多重比较(P<0.05 水平)、Pearson 相关性分析。
油柿果实成熟软化过程中单宁含量的变化规律如图1所示。由图1A 可知,可溶性单宁含量随着果实的成熟显著降低,果实软熟后含量由39.91 mg·g-1降至1.96 mg·g-1,低于可食用阈值(2 mg·g-1);不溶性单宁含量随着果实发育过程逐渐上升,尤其在果实发育后期,部分可溶性单宁转化为不溶性单宁,最后果实成熟软化后含量上升至73.13 mg·g-1;总单宁含量在成熟过程中呈显著下降的趋势,果实软熟后含量较软熟前降低了30.79 mg·g-1,最终降至75.09 mg·g-1。
油柿果实成熟软化过程中总酚和黄酮含量的变化规律如图1所示。由图1B 可知,在成熟初期(9月25 号至10月24 号),油柿果实中总酚和黄酮含量无显著性变化,随后呈显著下降的趋势,达到可食用状态后含量最低,分别为0.05 mg·g-1和5.87 mg·g-1。因此,在以总酚和黄酮为目的成分开发利用油柿果实时,最佳采收时期在10月下旬。
图1 油柿果实成熟软化过程单宁含量(A)和总酚、黄酮含量(B)的变化规律Fig.1 Changes of tannin content (A) and total phenolics,total flavonoids content (B) during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit
油柿果实成熟过程中可溶性糖含量的变化趋势如图2所示。由图2可知,可溶性糖含量呈先下降后上升的变化趋势,果实软熟后可溶性糖含量最高,高达88.50 mg·g-1,这可能与果实成熟软化过程中细胞壁组分的水解有关。果糖、葡萄糖和蔗糖含量的变化趋势如图2B所示,果糖和葡萄糖含量均表现出显著增加的趋势,蔗糖含量呈显著下降的趋势,其中葡萄糖含量>果糖含量>蔗糖含量,蔗糖与单糖(果糖+葡萄糖)的含量比值小于1,表明油柿果实糖积累类型为己糖积累型。
图2 油柿果实成熟软化过程中可溶性糖含量(A)和果糖、葡萄糖、蔗糖含量(B)的变化规律Fig.2 Changes of soluble sugar content (A) and fructose,glucose,sucrose content (B) during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit
WSP 主要由可溶性的果胶和果胶酸等组成,与细胞壁连接较疏松。由图3A 可知,油柿果实成熟初期,WSP 含量缓慢增长,到12月初显著增长,果实达到可食用程度后WSP 含量最高,达到4.44 mg·g-1。ISP 含量的变化趋势与WSP 相似,其在成熟初期增长显著,而到末期不再增加,在油柿果实成熟软化后,含量达到4.67 mg·g-1(图3B)。由图3C 可知,CSP 含量呈先上升后下降的变化趋势,果实软熟达到可食用程度后含量显著下降,因此,难溶型果胶CSP 含量的下降可能是油柿果实软化的重要生理特征。
图3 油柿果实成熟软化过程中WSP(A)、ISP(B)和CSP(C)含量的变化规律Fig.3 Changes of WSP (A),ISP (B) and CSP (C) content during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit
果胶降解酶与果实质地软化有着密切联系,是果实成熟软化的重要指标。如图4所示,油柿果实成熟软化期间,PG 和PL 活性在果实成熟初期(9—11月)无显著性变化,12月份后显著上升(P<0.05),果实软熟后活性最高,分别为13.02 mg·g-1h-1和134.45 U·g-1。PME 可催化果胶酯转变成果胶酸,为PG 酶提供作用条件。如图4B所示,PME 活性在油柿果实成熟过程中呈逐渐上升趋势,至12月初达到顶峰,随后果实软化时其含量稍微下降。
图4 油柿果实成熟软化过程中PG(A)、PME(B)和PL(C)活性的变化规律Fig.4 Changes of PG (A),PME (B) and PL (C) activity during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit
进一步对油柿果实成熟软化过程的生理指标进行相关性分析,结果(表1)表明,作为果实重要品质指标的可溶性单宁含量与总单宁、总酚和黄酮含量呈极显著正相关关系(P<0.01),与不溶性单宁、可溶性糖、果糖、WSP、ISP 含量以及PG、PME 和PL 活性呈极显著负相关关系(P<0.01);不溶性单宁含量与可溶性糖、果糖、WSP、ISP 含量及PG、PL 活性呈极显著正相关关系(P<0.01),与葡萄糖含量、PME 活性呈显著正相关关系(P<0.05),与总单宁、总酚和黄酮含量呈极显著负相关关系(P<0.01),与CSP含量呈显著负相关关系(P<0.05),说明油柿可溶性单宁在油柿果实成熟软化过程中逐渐转化为不溶性单宁,且转化过程与细胞壁组分的变化有关。
果解PL胶酶裂1胶酶果酯甲PME 1 0.421糖乳酶半酸聚醛PG多合结胶CSP共价果结胶ISP离合胶子果WSP性†溶果析水分性关糖Pearson 相蔗Sucrose标葡Glucose糖萄指化生理糖生果Fructose中程过可Soluble性熟成溶糖sugar实果柿1 油黄Total Table 1 Pearson correlation coefficients analysis of physiological and biochemical indexes of Diospyrosoleifera Cheng fruit酮flavonoids表总Total酚polyphenols总Total宁单tannin宁溶Insoluble单性tannin不宁溶Soluble单性tannin 1可指Index宁标可Soluble tannin单性溶1-0.801**宁单性溶不Insoluble tannin 1-0.676**0.980**宁单总Total tannin 1 0.964**-0.815**0.992**Total polyphenols 酚总1 0.929**0.855**-0.862**0.920**Total flavonoids 酮黄1-0.841**-0.708**-0.533*0.870**Soluble sugar -0.656**糖性溶可1 0.482-0.785**-0.915**-0.924**0.759**-0.943**Fructose 糖果1 0.927**0.293-0.705**-0.790**-0.867**0.599*-0.855**Glucose 糖萄葡1-0.907**-0.798**-0.057 0.428 0.520*0.600*-0.463 0.605*Sucrose 糖蔗1-0.339 0.573*0.711**0.927**-0.945**-0.859**-0.733**0.945**-0.836**WSP 胶果性溶水1 0.872**-0.556*0.736**0.921**0.731**-0.870**-0.949**-0.865**0.900**-0.935**ISP 胶果合结子离1-0.451-0.646**-0.348 0.197-0.081-0.821**0.479 0.339 0.097-0.622*0.250 CSP 胶果合结价共1-0.634*0.934**0.915**-0.403 0.581*0.788**0.880**-0.871**-0875**-0.740**0.952**-0.847**PG 酶酸醛糖乳半聚多0.656**0.131 0.773**0.494-0.893**0.903**0.933**0.267-0.563*-0.739**-0.779**0.619*-0.788**PME 酶酯甲胶果0.824**-0.600*0.731**0.880**-0.296 0.526*0.605*0.824**-0.879**-0.763**-0.652**关0.01 respectively.。性相著显0.843**平0.05 and P <的下0.01 水-0.753**P <0.05 和P <PL示表酶别解裂**分胶果† *和* and ** show significant correlation in P <
总酚、黄酮与可溶性糖、果糖、葡萄糖、WSP、ISP 含量及PG、PME 和PL 活性呈极显著负相关关系;可溶性糖与WSP、ISP 含量及PG和PL 活性呈极显著正相关关系(P<0.01),与CSP 呈极显著负相关关系;果糖、葡萄糖与WSP、ISP 含量及PG、PME 和PL 活性呈显著正相关关系,说明油柿果实成熟过程中,在细胞壁降解酶的作用下,细胞壁多糖和果胶组分降解,细胞壁结构分离,进而导致果实的软化和可溶性糖含量的升高。果实WSP 含量与ISP 含量、PG活性及PL 活性呈极显著正相关(P<0.01),相关系数分别为0.872、0.915 和0.880,与CSP 含量呈极显著负相关(P<0.01),相关系数为-0.646;PG 活性分别与PME、PL 活性呈极显著正相关(P<0.01),相关系数分别为0.656 和0.824,说明油柿果实成熟过程中,PG、PME 和PL 酶参与果胶的降解,使细胞壁结构解体,导致果实的软化。综上所述,油柿果实的成熟软化过程与单宁的转化、细胞壁的完整性有极强的联系,具体的软化机制需进一步探究。
可溶性糖是水果中的重要营养成分,其种类和构成比例在很大程度上影响果品的甜度和口感[21-22]。水果中的可溶性糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖[23]。本研究表明,油柿果实中葡萄糖含量最高,果糖次之,蔗糖最低,根据蔗糖与单糖的含量比值[24],油柿果实糖积累类型为己糖积累型;油柿果实成熟过程中葡萄糖和果糖含量逐渐增加,使果实逐渐变甜,由于果糖甜度高、葡萄糖甜度低[25],油柿果实葡萄糖含量高于果糖含量,使其在食用时甜而不腻。单宁和黄酮类物质是植物中广泛存在的次生代谢产物,具有抗氧化、抗衰老、降三高、提高免疫力等医疗保健作用[26-28]。本研究表明,油柿果实成熟后可溶性单宁含量降至可食用阈值以下,而仍保留较高水平的总单宁和总黄酮含量,且果实风味独特,甜而不腻,开发利用潜力巨大。
果胶是构成细胞初生壁和胞间中胶层的主要成分,在果实成熟之前呈不溶状态,随着果实成熟软化逐步降解,使果胶的平均分子质量和果胶多糖交联能力下降,细胞结构随之受损,导致果实软化[10]。通过对油柿果实成熟软化过程中果胶含量的动态分析,发现WSP 和ISP 含量在成熟软化过程中呈上升的变化趋势,果实达到可食用程度后含量最高;CSP 含量呈先上升后下降的变化趋势,果实软熟达到可食用程度后含量显著下降。齐秀东等[17]对‘京白梨’发育软化与果胶关系的研究表明,WSP 和ISP 含量逐渐增加,而CSP 含量先升后降;罗自生[9]对柿果实采后软化过程中细胞壁组分的研究表明,WSP 含量逐渐增加。这些研究结果均与本研究结果一致。
PG 是多聚-α-1,4-半乳糖醛酸聚糖水化酶,是可分解果胶或果胶酸酶类中的一种,亦称果胶酶或果胶解聚酶,能作用于果胶分子,使果胶降解、细胞壁结构解体,导致果实软化[29]。PME 主要功能是去除果胶中的半乳糖醛酸残基C-6 酯化基团,催化果胶酯酸转化为果胶酸,只有去酯化的果胶才能被PG 水解,PG 与PME 可协同发生作用[30]。果胶裂解酶是一种果胶酶,其主要功能是在果实成熟软化过程中参与果胶结构的裂解[31]。本研究表明,PME 活性在油柿果实成熟软化过程中呈逐渐上升的趋势,PG 和PL 在12月份果实软熟过程中活性显著上升。此外,相关性分析表明,PG、PME 和PL 活性与可溶性单宁、总单宁、总酚及黄酮含量呈极显著负相关关系,与果糖、葡萄糖含量呈极显著正相关关系;果实WSP 和ISP含量均与PG、PL 活性呈极显著正相关关系,CSP与PG、PL 活性呈极显著负相关关系,ISP 含量与PME 呈极显著正相关关系,说明PG、PME 和PL酶在油柿果实成熟软化过程中参与催化了细胞壁多糖和果胶组分降解,细胞壁结构分离,使难溶性果胶(CSP)发生降解或解聚成可溶性果胶多糖(WSP 和ISP),从而导致油柿果实的成熟软化、可溶性糖含量升高以及活性成分的变化。果实的成熟软化是一个复杂的生理生化过程。本试验中,油柿果实水溶性果胶和离子结合果胶含量的上升、共价结合果胶含量的下降是在PG、PME 和PL 的协同作用下完成的,而引起油柿果实细胞壁组分变化的深层机理还有待进一步揭示。下一步研究可基于油柿基因组图谱开展油柿果实单宁合成及转化的分子机制研究,以及油柿果实成熟的分子调控机理研究,以期为六倍体柿果实重要性状分子机理的解析提供参考。
本研究以不同发育时期的油柿果实为材料,测定了成熟软化过程中单宁、总酚、黄酮、可溶性糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、果胶含量以及半乳糖醛酸酶(PG)、果胶裂解酶(PL)和果胶甲酯酶(PME)活性的变化规律,为油柿果实的深入开发利用提供了理论依据。研究发现,在油柿果实成熟软化过程中,可溶性单宁、总酚和黄酮含量持续降低,不溶性单宁、WSP 和ISP 含量持续上升,CSP 含量先上升后下降;果糖和葡萄糖含量逐渐上升,蔗糖含量显著下降,其中葡萄糖含量>果糖含量>蔗糖含量,糖积累类型为己糖积累型;PME 活性逐渐上升,PG 和PL 活性在果实成熟后期显著上升,相关分析表明难溶型果胶CSP 含量与PG 和PL 活性呈极显著的负相关关系,CSP 含量的下降可能是油柿果实软化的重要生理特征之一。PG、PME 和PL 酶在油柿果实成熟软化过程中参与催化了细胞壁多糖和果胶组分降解,细胞壁结构分离,使难溶性果胶(CSP)发生降解或解聚成可溶性果胶多糖(WSP 和ISP),从而导致油柿果实的成熟软化、可溶性糖含量升高以及活性成分的变化。