光质对红阳猕猴桃愈伤组织生长速度和花青素合成的影响

解潇冬，刘晓莹，汪文杰，白 洁，李大卫，刘亚令

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.中国科学院武汉植物园猕猴桃产业技术工程实验室，湖北武汉430000）

猕猴桃属多年生木本雌雄异株藤本植物，种类繁多，目前市场上绿肉和黄肉的猕猴桃居多。红阳猕猴桃是由四川省自然资源研究所和苍溪县农业局共同选育出的优良品种，果肉四周绿色，中间呈红色，能够刺激食欲，增加消费者的购买欲望，且肉质细嫩，口感鲜香甜美，极具佐餐价值；还有易成花、坐果率高、早产丰产等优点[1]，使得红阳猕猴桃被大面积推广。植物组织培养广泛应用于科学研究，相比于在成熟植物体中进行试验，组培技术的应用能大大加快试验进程，且没有季节限制。目前，关于猕猴桃快繁体系的研究大多聚焦于激素的种类及配比，且趋于完善，但仍未发现光照等因素对该体系影响的报道。

大量研究表明，不同波长的光对植物生长有不同的影响。例如，红光可以增加番茄株高，但抑制根系活力。蓝光抑制番茄幼苗生长，降低叶绿素含量，而含有红蓝光的混合光不仅能促进番茄植株生长，还能提高其光合效率[2]，在茄子中也得到了类似的结果[3]。有研究表明，混合光源对植物生长的影响比单色光更显著，例如，对莴苣生长最有利的是红光∶蓝光为4∶1[4]；在混合光源（红光∶蓝光为2∶1，红光∶蓝光为1∶1）下，番茄幼苗根系表现出明显的高效生长[5]；红光∶蓝光为4∶1时，香蕉组培苗生长最快[6]。

花青素是一种存在于植物中的天然色素，在食品染色和染料加工中有广泛应用；同时花青素还是一种强力的自由基清除剂，比维生素C、维生素E的抗氧化能力高数十倍，在神经和心血管疾病防治方面效果显著，在抗炎、抗癌保健方面也有很好的前景[7]。

近年来随着研究的深入，花青素合成路径逐步完善，该过程中许多相关酶基因的功能已经被证实[7]。另外，还有大量研究表明，由MYB、bHLH、WD40等转录因子组成的复合体对花青素的合成也有重要作用。例如，拟南芥中AtMYB11、At－MYB12、AtMYB111、AtTTG1对花青素合成的早期调控基因有激活作用[8]；苹果MdMYB1、MdMYB16、MdTTG1对苹果着色有重要作用[9]；此外，百合（LlMYB19）、牡丹（PsMYB58）、柿子（DkMYB10）、葡萄（VvMYBA1和VvMYBA2）以及草莓（FaMYB10）相继被报道在花青素的合成中发挥作用[10-14]。

红阳果肉中花青素的积累是果肉呈红色的关键所在。已有研究表明，干扰AcMYB75和AcMYB123，红阳果肉颜色会变浅[15-16]；还有AcMYB10、AcMYB110也与红阳花青苷的积累相关[17-18]；此外，低温可以使猕猴桃花青素合成相关基因AcMYB1-1和AcMYB5-1表达水平提高，进而使花青素含量升高，而高温则会抑制花青苷的合成[19-20]。李贵生[21]在红阳和金艳果实转录组比较分析中发现，MYB-A72只存在于红阳的转录本中，bHLH-B36和WD40-A126可能参与MYB-bHLH-WD40复合体的形成，靶向调控CHI2、FLS1和CYP98A1等花青素合成相关基因。尽管已有大量研究，较为清楚地阐述了花青素的合成机制，但在猕猴桃中关于光在花青素合成中的作用仍未解释清楚。

本研究在前人的基础上，以光质为变量，红阳猕猴桃愈伤组织为研究对象，测量并分析6种光质对红阳猕猴桃愈伤组织生长速率、花青素含量以及相关基因表达量的影响，希望筛选出最适宜红阳猕猴桃离体培养的光照条件，并探明光照对花青素合成的影响规律，同时发掘花青素合成相关基因中的主要光响应因子，为后期研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

红阳猕猴桃材料取自中国科学院武汉植物园国家猕猴桃种质资源圃。

1.2 试验设计

试验于2019年8月在中国科学院武汉植物园猕猴桃产业技术工程实验室中进行。以红阳猕猴桃的新鲜叶片为外植体，经过植物组织培养诱导生成愈伤组织，然后将愈伤组织重新切分并置于6种LED灯下，分别为：白光（波长450～465 nm）、红光（波长650～700 nm）、蓝光（波长465～480 nm）、红光∶蓝光为1∶1、红光∶蓝光为1∶3和红光∶蓝光为3∶1（图1），环境温度设定在25℃下12 h光明/12 h黑暗。

培养基配方：4.42 g/L Murashige & Skoog with Vitamins＋0.9%琼脂＋3%蔗糖＋1 mg/L TDZ（噻嗪隆）＋0.5 mg/L IAA（吲哚-3-乙酸）。

1.3 愈伤组织直径和芽长的测定

在6种LED光源下，测定红阳愈伤组织第15、25、40、100天的直径和芽长。愈伤组织的直径用交叉法测量，每个样本设40个重复。愈伤组织分化为芽后，测量愈伤组织的芽长，并统计每皿分化出芽的数量，计算平均值。每组设15个重复。

式中，L100为100 d时愈伤组织的直径，L15为15 d时愈伤组织的直径。

1.4 愈伤组织及叶片花青素含量测定

分别取培养30、60、90 d的愈伤组织及其分化形成的叶片，液氮冷冻并研磨成粉末状，将0.1 g粉末状组织样品在600 μL提取缓冲液（含1%HCl的甲醇）中于4℃温育6 h。提取后，向每个样品中加入200 μL水和200 μL氯仿，然后在4℃下以14 000×g离心5 min以沉淀植物材料，并使用酶标仪在530、657 nm处读取吸光度。

1.5 猕猴桃花青素合成相关基因表达分析

使用植物RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）分别提取不同光质处理的愈伤组织及其分化形成的叶片的总RNA，反转录成cDNA并稀释3倍备用，终浓度为147.46 ng/μL。以猕猴桃中Actin为内参基因进行qPCR分析，实时荧光定量PCR检测系统由Applied Biosystems公司提供，型号为7500FAST；反应体系中qPCR Mix加5 μL，正反向引物各加0.2 μL，cDNA加1 μL，加无菌水补齐到10 μL；反应步骤为：94℃预变性30 s，然后进行45个循环的94℃变性5 s、60℃退火30 s。所用引物如表1所示。

表1 实时荧光定量PCR分析所用引物

1.6 愈伤组织花青素含量与相关基因表达量相关性分析

用Excle对花青素含量和相关基因表达量进行相关性分析，使用CORRE函数计算相关系数，并将结果用热图形式表现出来。

2 结果与分析

2.1 不同光质下愈伤组织及芽生长效率分析

将愈伤组织置于6种LED光源下进行培养，随着培养时间延长，各种光质下愈伤组织生物量都有所增加，其中，白光和红光增加最为明显，且红光照射诱导产生芽的数量明显多于其他光照，愈伤组织的颜色相对于其他光质较浅（图2）。由表2可知，15 d时，芽的数量呈红光、红光∶蓝光为1∶3、蓝光、红光∶蓝光为3∶1、白光、红光∶蓝光为1∶1依次递减；培养至30 d时，各个光质下芽数量的增量大致相同，但其愈伤组织的直径及芽的长度存在差异。

表2 不同光质下平均每皿芽的数量比较 个

从图3可以看出，不同光质条件下愈伤组织的直径和芽长均随愈伤组织发育时间的延长而增加。在4个发育阶段，红光条件下愈伤组织直径最大，红光∶蓝光为1∶3次之。在红光照射下，各愈伤组织的芽长最长。通过计算愈伤组织直径和芽长的平均生长速率，发现在6种光质下，红光和红光∶蓝光为3∶1下愈伤组织直径的平均生长速率最高。红光处理下，芽的平均生长率高于其他处理；红光∶蓝光为3∶1处理下，芽的平均生长速率最低。白光和红光∶蓝光为1∶3下愈伤组织的直径和芽生长速率处于较高水平，而蓝光和红光∶蓝光为1∶1下愈伤组织的生长速率处于较低水平。通过统计发现，不同光质下不同芽长度占比存在差异。在红光下，芽长占比最多为2～3 cm，占43%，说明红光促进了芽的生长。而在蓝光和红光∶蓝光为1∶1条件下，红阳芽长在0～1 cm占比最大，说明这2种光都抑制了红阳芽的生长。此外，100 d时红光下0 cm处的芽长占比最小，大于3 cm处的芽长占比最大。由此可见，红光下猕猴桃愈伤组织的生长速度最快。

2.2 不同光质下愈伤组织及叶片花青素含量分析

从图4可以看出，随着时间的延长，白光和红光下叶片花青素的含量逐渐增加，而蓝光、红光∶蓝光为1∶1、红光∶蓝光为1∶3处理则呈现先降后升的规律，红光∶蓝光为3∶1处理在3个时期花青素含量没有明显差异。以白光作为对照，蓝光下30、90 d、红光∶蓝光为1∶1下30 d、红光∶蓝光为1∶3下90 d花青素含量与对照组相当，其他光照条件和其他时期花青素含量均明显降低。愈伤组织中花青素含量较叶片中整体水平偏高；随着时间的推移，白光和红光∶蓝光为3∶1下花青素含量小幅上升，红光下花青素的含量在3个时期基本恒定；而蓝光下，第1时期花青素含量远高于平均水平，随着时间延长大幅下降；红光∶蓝光为1∶3下花青素含量也呈缓慢下降的规律，红光∶蓝光为1∶3仅在60 d时，花青素含量跃升，而后又急剧降低。整体来看，相对于白光，红光∶蓝光为1∶3愈伤组织的花青素含量与之相当，红光和红光∶蓝光为3∶1有明显降低，而蓝光和红光∶蓝光为1∶1则明显升高。综上，红光和红光∶蓝光为3∶1能抑制叶片及愈伤组织中的花青素合成，而蓝光和红光∶蓝光为1∶1能促进愈伤组织中花青素的合成，在叶片中效果不明显。

2.3 不同光质处理愈伤组织花青素合成相关基因表达量分析

定量结果表明（图5），每个基因在不同光质、不同时期的表达量都存在差异性。CHS主要在第1时期和第3时期发挥作用，第2时期表达水平整体偏低，白光、蓝光以及红光∶蓝光为1∶1的组合中CHS在第1时期的表达水平都最高，而红光∶蓝光为1∶3和红光∶蓝光为3∶1处理，CHS在第3时期的表达水平明显提高。F3′H在不同光质、不同时期的差异不明显，仅在90 d的蓝光处理中表达量提升2倍。DFR、ANS为前期主要的功能基因，它们在第1时期的表达量明显高于其他2个时期，这2个基因在红光下表达水平极低，并且红光∶蓝光为1∶3组合中表达量也不高。反之，CHI、UFGT、CRY则为后期的主要功能基因，它们的表达量随着时间呈现上升或小幅回落而后上升的趋势，其中，蓝光能促进CHI、UFGT、CRY的表达，而红光则有抑制作用，3种红蓝组合下CHI、UFGT、CRY的表达水平与白光一致。F3H在白光和红光下表达水平都不高，相比较而言，红光∶蓝光为1∶1和红光∶蓝光为1∶3的表达量有小幅增加，蓝光和红光∶蓝光为3∶1能明显提升F3H的表达水平。作为红阳猕猴桃调控红色果肉形成的关键转录因子，MYB110基因的相对表达量整体偏低，主要在第2个时期发挥作用，不难看出，其在红光及红光∶蓝光为3∶1的3个时期基因表达量保持一致，相对于白光而言，仅在红光∶蓝光为1∶3的组合中表达量有明显提升，其余组合差异不明显或略微减低。此外，叶片中各个基因的表达水平极低，不做分析。综上，红光抑制CHS、DFR、ANS、UFGT、CRY等基因的表达，进而影响花青素的合成，而蓝光则能提升CHS、F3H、DFR、CHI、UFGT、CRY、F3′H等基因的表达水平进而促进花青素的合成，混合光红光∶蓝光为1∶3提升CHS、F3H、F3′H、MYB110的表达量以及抑制DRF、ANS的表达水平从而影响花青素的含量；红光∶蓝光为3∶1则促进CHS和F3H的表达，抑制UFGT的表达来调控花青素的合成。

2.4 不同光质下愈伤组织花青素含量和相关基因相关性分析

相关性分析结果表明（图6），不同基因的表达量与花青素含量的相关性在不同光质下存在差异。CHS的表达量在白光下与花青素含量呈显著负相关，而在蓝光照射下呈显著正相关，其他光处理没有相关性或相关性不显著；与之相反的是CHI和CRY，在白光下显著正相关而蓝光下显著负相关，红光∶蓝光为1∶3下CRY的表达量与花青素负相关也达到显著水平；DFR和ANS相关性分析结果类似，均为白光显著负相关，蓝光和红光∶蓝光为1∶3则高水平正相关，红光为中等水平的负相关；红光下的F3H和红光∶蓝光为1∶3下的F3′H的表达量与花青素含量呈显著负相关，红光∶蓝光为1∶3下的F3H和红光∶蓝光为1∶1的F3′H相关性明显，为正相关；UFGT的表达量在不同光质下与花青素含量中度相关或不相关；MYB110的表达量与花青素含量仅在红光∶蓝光为1∶1下显著正相关，其余光质下相关性水平不高。

3 结论与讨论

本研究探讨了6种LED光组合下红阳猕猴桃愈伤组织的生长效率，红色照射下红阳愈伤组织直径和芽长的平均生长速率显著高于其他光质下。单色红光促进愈伤组织的生长，愈伤组织颜色变浅，推测红光照射改变了红阳愈伤组织的薄壁细胞，影响了其遗传转化活性。单色蓝光对红阳愈伤组织的生长速率和芽的伸长有抑制作用。该结果与之前的报道相似，红光显著促进了番茄幼苗株高的增加，但根系活力下降，强壮的幼苗指数下降；红、蓝光结合可增加番茄幼苗叶片光合色素含量，提高光合效率，促进植株生长[2]。不同比例的红蓝光还能提高黄瓜根系活力和叶面积，红光∶蓝光为4∶1最有利于生菜的生长等[22]。此外，与单色光质相比，红光∶蓝光为1∶1下愈伤组织的直径和芽长均受到抑制。红光∶蓝光为1∶3组合对愈伤组织直径和芽长有较强的促进作用，而红光∶蓝光为3∶1组合对愈伤组织直径有显著的促进作用，对芽长有显著的抑制作用，这些结果与袁华玲等[23]研究的红光∶蓝光为3∶1的LED灯下对萼猕猴试管苗生长最好的结果有些出入，推测可能是品种不同，倍性不同所导致，值得进一步探究。

花青素含量与光有关已经被证实，紫薯块根花青素的含量在黑膜下更高[24]。余敏[25]对猕猴桃果子着色的研究发现，强光能促进中华猕猴桃花青素的积累。在本研究中，红光和红光∶蓝光为3∶1对叶片和花青素的合成均有所抑制，蓝光和红光∶蓝光为1∶1对愈伤组织花青素的合成有促进作用。相较于余敏[25]的研究，本研究光源更为丰富，更清楚的解释了不同光源对猕猴桃花青素含量的影响。前人研究表明，在草莓中，随着光强的增加FaCHS、FaCHI、FaF3H、FaF3′H、FaDFR、FaANS、FaUFGT等基因表达水平下降[26]，本研究从不同光质的处理中发现，红光对CHS、DFR、ANS、UFGT、CRY等基因表达抑制而使花青素合成受阻，而蓝光则对CHS、F3H、DFR、CHI、UFGT、CRY、F3′H等基因表达有促进作用，花青素积累增加；红光∶蓝光为1∶3促进CHS、F3H的表达，但抑制UFGT的表达，红光∶蓝光为3∶1促进CHS和MYB110的表达，混合光对基因表达水平的影响同样调控着花青素合成。张彬等[27]证实F3H、DFR、ANS、UFGT过表达会促进羽衣甘蓝花青素积累增加而颜色加深[27]，这与本研究的结果一致。此外，花青素含量与相关基因表达量的相关性会随着光质的变化而改变。

综上所述，本研究探究了不同光质下红阳猕猴桃愈伤组织及芽的生长速率，结果表明，红光最适合红阳猕猴桃离体培养，蓝光和红光∶蓝光为1∶1组合最适宜花青素的积累，同时本研究将不同光质下花青素的含量与相关基因的表达量相关联，发现不同基因对不同种类的光质响应程度不同。研究结果对猕猴桃快繁体系的优化有一定的参考意义，同时为花青素在不同光质下的调控研究提供了新的思路。