红鳍东方鲀B-FABP 基因SNPs 筛选及其与生长性状关联分析

杨 晓，马文超，杨 金，苟盼盼，包玉龙，王秀利，刘圣聪，仇雪梅

（1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023；2.大连天正实业有限公司，辽宁 大连 1 160116）

脑型脂肪酸结合蛋白（Brain-like fatty acid binding proteins，B-FABP）最初是在脑组织中发现，主要功能是结合以及运输多不饱和脂肪酸PUFAs，这些脂肪酸在生长早期的细胞分化、突触活化以及光感受器膜的生物合成中必不可少[1-3]。在对北京油鸡进行全基因组分析中发现，B-FABP基因与北京油鸡的体质量、屠体性状有显著相关性[4]，由此分析B-FABP基因可以作为影响生长性状的候选基因。对斑马鱼（Danio rerio）进行原位杂交研究发现，B-FABP在斑马鱼早期发育的中枢神经系统中高度表达[5]。但目前尚未见B-FABP基因对鱼类生长调控作用的研究报道。

全基因组重测序技术广泛应用于遗传变异检测、性状基因定位等方面研究[6]。Li 等[7]对48 份家猪样本进行全基因组重测序，与55 个欧亚野猪和家猪基因组数据对比分析，发现了低氧适应、能量代谢等268 个基因位点，揭示了藏猪高原低氧适应的遗传基础；朱文[8]对“金鳞一号”皇姑鱼（Nibea albiflora）的体质量、体长、体高、体厚四个生长性状进行了基因组关联分析，筛选出了13 个与生长性状有关的候选基因。

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是一种肉质鲜嫩、营养丰富的重要经济鱼类，在我国多分布于中部和北部海域，是我国重要的出口水产品之一。近年来海洋环境污染严重，致使红鳍东方鲀自然种群资源不断衰减，但其人工养殖规模逐年扩大，因此选育具有优良生长性状的红鳍东方鲀群体有实际经济意义。本研究以红鳍东方鲀为材料，利用全基因组重测序技术筛选B-FABP基因上的SNPs 位点，并对突变位点进行基因型分型，利用SPSS 软件分析B-FABP基因的SNPs 与红鳍东方鲀生长性状之间的关系，以期为探究B-FABP对红鳍东方鲀生长性状的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用鱼均取自河北省唐山市牧海水产养殖有限公司的红鳍东方鲀群体，共308 尾。养殖周期为1 a，分别在6 月龄和12 月龄时进行生长性状测量和样品采集，其中6 月龄的体质量范围为69.5～458.6 g，12 月龄的体质量范围为162.8～ 630.3 g。

1.2 方法

1）取样及生长性状测定：体质量用电子天平称量，精确到0.1 g；形态性状的测量方法参照王新安等[9]的方法，11 个形态性状分别为体质量、体长、体全长、尾柄长、体高、头长、头躯长、尾长、尾柄高、尾柄宽以及体宽，测量时利用手机支架固定手机进行拍照，尽量保证拍照时样本位置基本一致，测量参数结果精确到0.001 cm。

2）基因组提取：采集鱼鳍用于基因组提取。使用海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）对采取的样品进行基因组制备，将提取的基因组DNA 放于-20 ℃保存。

3）基因组重测序：将提取得到的基因组送至北京生工生物工程股份有限公司进行文库构建。

4）原始数据质控和过滤：原始测序数据利用Fastp（v0.11.5）进行质控，对数据进行过滤，得到质量较好的数据。

5）SNPs 位点的检测和标记：用红鳍东方鲀参考序列与获得的测序序列进行比对，并进行变异位点的筛选。

6）红鳍东方鲀生长性状及其与SNP 的生物统计分析：采用SPSS 22.0 软件进行相关性分析，建立生物统计模型式为：Yij=μ+Gi+eij，其中Yij表示某个性状第i基因型的第j个个体的生长观测值；µ是实验观测值所有样本的均值；Gi是基因型i的有效生物学价值；eij表示随机误差对观测值的影响。将B-FABP基因上的SNP 位点不同基因型与红鳍东方鲀的体质量（BWH）、体长（BL）、体全长（TL）、尾柄长（CPL）、体高（BD）、头长（HL）、头躯长（HL+TR）、尾长（TA）、尾柄高（CPD）、尾柄宽（CPB）、体宽（BW）共11 个形态性状进行关联分析，计算结果用平均值±标准差（mean±SD）表示，P＜0.05 表示显著相关，P＜0.01 表示极显著相关。

2 结果与分析

2.1 6 月龄和12 月龄红鳍东方鲀生长性状关联分析

本研究验共筛选到3 个SNP 位点，其基因型和红鳍东方鲀个体数统计见表1。6 月龄和12 月龄红鳍东方鲀群体中各SNPs 位点与生长性状相关性结果见表2、3。

表1 红鳍东方鲀B-FABP 基因SNPs 位点基因型分型Table 1 Genotyping map of the SNPs locus of the B-FABP gene of Takifugu rubripes

从表2 可以看出，6 月龄红鳍东方鲀个体中，C442T 位点的多态性与生长性状均无显著相关（P＞0.05），CC 基因型个体显著高于TT 基因型个体（P＜0.05），其他性状均没有达到显著水平；G676A和C731A 位点的多态性与大多数生长性状都存在显著关联性（P＜0.05）。其中，G676A 位点的GA基因型个体的体质量、体高、尾柄宽均显著高于AA 基因型个体（P＜0.05），GG 基因型的头长显著高于GA 基因型（P＜0.05）；C731A 位点的AA基因型个体的体质量、体长、体全长、尾柄长、体高、头长、尾长、尾柄高均显著高于CC 基因型（P＜0.05），并且在体长、体全长、尾柄长、头长、尾长和尾柄高上达到极显著水平（P＜0.01），AA基因型的个体在体长、体全长、尾柄长、尾长均显著高于AC 基因型个体（P＜0.05），CC 基因型个体的尾柄长、头长、尾长均显著高于AC 基因型（P＜0.05），其中在头长性状上达到极显著水平（P＜0.01）。

表2 B-FABP 基因SNP 位点基因型与6 月龄红鳍东方鲀生长性状的关联分析Table 2 Correlation analysis between the SNP genotype of B-FABP gene and the growth traits of 6-month-old Takifugu rubripes

表3 可以看出，在12 月龄红鳍东方鲀个体中，各突变位点与6 月龄个体一致。其中C442T 位点与生长性状没有显著相关（P＞ 0.05）；G676A 位点与大多数生长性状都存在显著关联，GA 基因型个体的体全长、体高、头长、头躯长、尾柄宽、体宽均显著高于GG 基因型个体（P＜0.05），并且在体全长、体高、头长、头躯长、体宽上达到极显著水平（P＜0.01），GG 基因型个体体长与尾长极显著高于GA 基因型个体（P＜0.01），GA 基因型个体的体宽性状显著高于AA 基因型个体（P＜0.05）；C731A 位点只与体宽性状有显著相关，AA 基因型个体的体宽显著高于CC 基因型个体（P＜0.05），CC 基因型个体的体宽显著高于AC 基因型个体（P＜0.05），其他性状均没有达到显著水平（P＞ 0.05）。

表3 B-FABP 基因SNP 位点基因型与12 月龄红鳍东方鲀生长性状的关联分析Table 3 Correlation analysis between the SNP genotype of B-FABP gene and the growth traits of 12-month-old Takifugu rubripes

2.2 6 月龄和12 月龄红鳍东方鲀表型性状关联分析

为了解不同生长阶段红鳍东方鲀各主要性状之间的关系及影响，对不同月龄的红鳍东方鲀表型形状进行了相关性分析，结果见表4、5。6 月龄红鳍东方鲀各表型之间为正相关，其中体质量和体长、体高相关性均较大，与体全长较次之；12 月龄红鳍东方鲀各表型之间为正相关，其中体质量、体长和体全长均与体高相关性较大。

表4 6 月龄红鳍东方鲀的表型相关分析Table 4 Correlation analysis of phenotype of redfin pufferfish at 6 months old

2.3 不同SNPs 位点的遗传连锁分析

通过对检测到的3 个SNPs 位点进行遗传连锁分析。图中白色和灰度图中的数字表示相关系数R2×100 的值，该值≥80 时表示两个位点之间有连锁反应，由此可以得出这三个位点之间没有连锁关系，为独立遗传（图1）。

图1 SNPs 位点遗传连锁图Fig.1 SNPs genetic linkage map

表5 12 月龄红鳍东方鲀的表型相关分析Table 5 Correlation analysis of phenotype of redfin pufferfish at 12 months old

3 讨论

使用脂肪酸结合蛋白基因作为腹脂率、腹脂重以及生长性状的分子标记候选基因，在猪[10]、鸡和牛[11-12]等有报道，如仇雪梅、王启贵等[13-15]对鸡细胞外脂肪酸结合蛋白（Ex-FABP）的单核苷酸位点的研究发现，Ex-FABP的SNP 位点对鸡的屠体性状有显著关联，并且肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）基因上的SNPs 位点变化对肉鸡体质量性状有显著影响[16]；对北京鸭体尺以及胴体性状与FABP2基因的SNPs 研究发现，该基因可以作为北京鸭体尺和屠体性状标记辅助选择的分子标记[17]；吴丹[4]在对北京油鸡体质量和屠体性状进行全基因组关联分析时发现，B-FABP基因与其体质量、屠体性状有显著相关性；在鱼类中，夏正龙[18]通过对建鲤（Cyprinus carpiovar.Jian）脂肪酸结合蛋白基因进行SNPs 的筛选，发现其突变位点与建鲤的增重有显著相关。

本研究首次对B-FABP基因的遗传突变与红鳍东方鲀生长性状的之间进行关联分析。结果显示，红鳍东方鲀B-FABP基因上发现3 个SNPs 位点，分别为C442T、G676A、A731C。其中，第二外显子上一个（C442T），第三内含子上两个（G676A、A731C），并且通过遗传连锁分析发现，三个SNPs位点没有连锁现象。第二外显子上的突变导致氨基酸的改变，原来的苏氨酸（Thr）被替换为甲硫氨酸（Met）。笔者对此位点中的三种基因型和红鳍东方鲀的生长性状进行关联分析，发现6 月龄的体质量等相关性状明显CC 基因型的高于TT 基因型，但由于该多态性位点TT 基因型群体数量较少，并且不同个体之间标准差较小，导致数据离散程度较低，故使用SPSS 22 分析时其体质量性状虽平均值相差较大，但并没有显著差异，因此后续会加大检测的群体数量，对结果进行充分验证；第三内含子上的突变与6、12 月龄的红鳍东方鲀个体的大多数生长性状均有显著关联，其中G676A 位点中的GA基因型个体体全长、体高、头长、头躯长、尾柄宽、体宽等生长性状显著高于GG 基因型个体（P＜0.05）。

本研究发现SNPs 突变位点位于内含子区域。虽然内含子不具有编码氨基酸的能力，但是已有较多研究结果证明发生在内含子内的突变也可对生物生长性状产生影响，如对藏羊[19]（Ovis aries）MC4R基因的研究中发现，与其生长性状密切相关的SNP 位点位于第一内含子上；张世勇等[20]对斑点叉尾鮰（Ictalures punctatus）MSTN基因与生长性状的关系研究发现，与其体质量、体长显著相关SNP 标记位于第二内含子上；谢淑媚等[21]在缢蛏（Sinonovacula constricta）IGFBP基因第1 个内含子中发现1 个与体质量、壳长显著相关的SNP 位点；王启贵等[22]在鸡L-FABP基因的5′侧翼区检测到2个SNPs 位点（G204A 和T205C），这两个多态性位点与鸡的腹脂质量和腹脂率有显著相关性；同时，徐松松等[16]研究发现，鸡的F2 资源群体中在I-FABP基因的内含子1 和内含子2 中发现2 个SNPs，与鸡的生长性状也显著相关。虽然内含子上的突变不会影响编码蛋白质的合成，但是与基因转录调控有关[23-25]，所以内含子中SNPs 位点可能与基因组区域中相关联的关键基因突变位点有连锁反应[26-27]。因此，在内含子上的突变有可能对B-FABP基因的翻译、结构和功能产生影响[28]。这些结果与本研究结果相吻合，证明B-FABP基因上的SNPs 对红鳍东方鲀的生长性状有一定影响，因此其可作为红鳍东方鲀分子育种的候选分子标记，也可以作为生长性状的候选基因。