邻苯二甲酸酯暴露与2岁幼儿神经发育的关联

许思楠，郭剑秋，张济明，朱效宁，刘萍，王彦娜，常秀丽，邬春华，周志俊

复旦大学公共卫生学院/公共卫生安全教育部重点实验室，上海 200032

邻苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一类广泛使用的人工合成有机化合物［1］，根据其相对分子质量和化学性质分为低分子量PAEs（low molecular weight phthalate，LMWP，分子量＜250）和高分子量PAEs（high molecular weight phthalate，HMWP，分子量＞250）。LMWP主要应用于化妆品、个人护理用品、香水和药品；HMWP在塑料食品包装袋、玩具、建筑材料中广泛存在。其中，个人护理用品是人群暴露于PAEs的首要来源。由于PAEs在塑料聚合体中以非共价键的方式存在，因此塑料制品中PAEs会不断逸出至环境中，可在水、大气、土壤等环境介质中广泛检出［2］。

PAEs 可以通过消化道、呼吸道、皮肤［3］等途径进入人体。PAEs 进入人体后迅速代谢，代谢物大部分经尿液排出体外，因此采用尿液作为生物监测样本进行PAEs 暴露评估以反映人群暴露水平［4］。PAEs 具有内分泌干扰作用，动物实验研究发现PAEs 会通过干扰甲状腺功能［5］、过氧化物酶受体家族（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）激活［6］、钙稳态［7］等影响健康。儿童处于快速生长发育的关键时期，代谢功能尚未发育完全，对环境污染物暴露更为易感，特别是婴幼儿期儿童由于手口行为多、呼吸带低及单位体重摄入膳食多等原因，暴露于PAEs的机会较多，且暴露水平较高［8］。目前流行病学研究报道PAEs暴露与幼儿神经发育不良、认知行为问题有关［9］，但结论尚不一致。本研究通过检测尿样中10 种PAEs 代谢物评估2 岁幼儿的PAEs 暴露负荷，同时使用“Gesell 量表0～3 岁智力发育诊断量表［10］（后简称Gesell 量表）”评估幼儿神经发育状况，探究PAEs 暴露与低龄儿童神经发育的关联，为保护儿童健康提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2009—2010年，课题组在江苏省射阳县某妇产科医院建立“射阳小型出生队列”开展研究［11］，于2011年继续随访队列中的2 岁幼儿共405 人。随访内容包括问卷调查、幼儿尿液样本采集以及儿童智力发育评估。排除尿液不足或缺失者66 人，神经发育指标缺失者1 人，母亲孕期患有妊娠期高血压和妊娠期糖尿病5 人，双胞胎2 人，本研究最终纳入331 名儿童。儿童监护人均已签署知情同意书，并协助完成相关调查。该项目获得复旦大学公共卫生学院伦理审查委员会批准（批准号：IRB#2021-02-0875）。

1.2 问卷调查

采用课题组自行编制的调查问卷，由统一培训的调查员通过面对面询问方式向儿童监护人采集信息。问卷调查内容主要包括：疾病史、社会人口学信息、居住环境信息和可能接触PAEs 的行为和生活习惯。

1.3 神经发育评估

2 岁幼儿智力和神经行为发育的评估使用Gesell量表，该量表在国内广泛用于评估儿童神经智力发育。Gesell 量表共有28 个条目，对儿童动作能区、应物能区、言语能区、应人能区的神经发育水平进行评估。经过年龄校正计算各能区的发育商（development quotient，DQ）和总DQ平均分，DQ评分越高代表幼儿的神经发育状况越好。总DQ平均分≥85，表示幼儿神经发育正常；总DQ 平均分＜84，表示幼儿神经发育迟缓。本研究由经培训合格的上海交通大学医学院附属新华医院的4 位儿科医生作为评估医师独立完成幼儿神经发育量表评估，并记录评估医师编号信息作为模型协变量。

1.4 尿样采集与PAEs检测

在监护人协助下，调查员在研究现场用15 mL 离心管（美国Corning）采集幼儿尿样，立即转移至-20℃低温冰箱，并于1 周内采用冷链转移至实验室保存于-80℃超低温冰箱中。

本研究检测幼儿尿中10 种PAEs 代谢物，分别为邻苯二甲酸单甲酯（mono-methyl phthalate，MMP）、邻苯二甲酸单乙酯（mono-ethyl phthalate，MEP）、邻苯二甲酸单丁酯（mono-n-butyl phthalate，MBP）、邻苯二甲酸单异丁酯（mono-iso-butyl phthalate，MiBP）、邻苯二甲酸单苄基酯（mono-benzyl phthalate，MBzP）、邻苯二甲酸单（3-羧基丙基）酯［mono-（3-carboxypropyl）phthalate，MCPP］、邻苯二甲酸单（2-乙 基己基）酯［mono-（2-ethylhexyl） phthalate，MEHP］、邻苯二甲酸单（2-乙基-5-羟己基）酯［mono-（2-ethyl-5-hydroxy-hexyl） phthalate，MEHHP］、邻苯二甲酸单（2-乙基-5-氧己基）酯［mono-（2-ethyl-5-oxo-hexyl） phthalate，MEOHP］、邻苯二甲酸单（5-羰基-2-己戊基）酯［mono-（2-ethyl-5-carboxy-pentyl）phthalate，MECPP］的质量浓度。其中，MMP、MEP、MBP和MiBP 属于LMWP；MBzP、MCPP、MEHP、MEHHP、MEOHP 和MECCP 属于HMWP。此外，MEHP、MEHHP、MEOHP 和MECCP 均为邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯［di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP］的代谢产物。

采用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）（Agilent 1290/6460，美国）进行检测［12］。尿样解冻后加入β-葡萄糖苷酸酶溶液酶水解，经固相萃取提取净化得到洗脱液，洗脱液氮气吹干后经过复溶，超声、涡旋振荡、过滤等步骤后上机检测。该方法MMP、MEP、MEOHP、MEHHP、MECPP 质量浓度的检出限均为0.1 μg·L-1，其余5 种代谢产物质量浓度的检出限均为0.2 μg·L-1；回收率为94.94%～117.81%，日内、日间相对标准偏差均小于10%。

尿中肌酐测定采用南京建成科技有限公司生产的血、尿肌酐测定试剂盒（除蛋白法）。

1.5 统计学分析

使用SPSS 20.0 软件分析数据。

采用频数和构成比描述研究对象的社会人口学信息；使用均值±标准差（±s）描述幼儿Gesell 量表各能区DQ评分情况。PAEs代谢物质量浓度呈偏态分布，经肌酐校正对数转换后近似正态分布。采用几何均数G、几何标准差GSD和百分位数描述幼儿尿PAEs 暴露水平的分布情况，PAEs代谢产物质量浓度低于检出限时采用LOD/ 赋值。LMWP 总浓度以CLMWP表示，为MMP、MEP、MBP、MiBP浓度之和（单位为μmol·g-1）；HMWP 总浓度以CHMWP表示，为MBzP、MCPP、MEHP、MEHHP、MECPP、MEOHP浓度之和（单位为μmol·g-1）；DEHP总浓度（CDEHP）为MEHP、MEHHP、MECPP、MEOHP浓度之和（单位为μmol·g-1）；PAEs代谢物总浓度（CPAEs）为10种代谢物浓度之和（单位为μmol·g-1）。使用Mann-WhitneyU检验比较不同性别幼儿的DQ评分情况。

协变量的选择根据既往文献［4］或者与PAEs 暴露和神经发育指标相关联的信息。主要包括母亲年龄、母亲学历、母亲职业、家庭年收入、母乳喂养时长、儿童性别、被动吸烟状况、居住地、评估医师编号。采用广义线性模型探究2 岁幼儿PAEs 暴露与Gesell量表各能区DQ 得分的关系，并进行性别分层分析；采用广义相加模型进一步探究PAEs 暴露与Gesell 量表各能区DQ 得分的剂量反应关系；使用方差膨胀因子诊断模型的多重共线性。此外，敏感性分析将2 岁幼儿尿双酚A（Bisphenol A，BPA）、有机磷农药（organophosphate pesticides，OPs）以及铅（Pb）、镉（Cd）、汞（Hg）质量浓度纳入作为协变量检验模型的稳健性。检验水准α=0.05。

2 研究结果

2.1 基本信息

在研究纳入的331 名2 岁幼儿中，男童189 名（57.1%），女童142 名（42.9%）。幼儿母亲分娩年龄为（26.03±5.49）岁，39.0%的幼儿母亲职业为家庭主妇，70.4%的幼儿母亲受教育水平为初中及以下；75.8%的幼儿居住在集镇和农村地区；48.9%的幼儿存在被动吸烟情况；有83.1%、95.2%、60.4%的幼儿存在使用塑料奶瓶、塑料玩具、塑料餐具的情况。本研究将纳入与排除的幼儿基本特征进行比较，结果显示所有纳入与排除对象在人口学因素上差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见补充材料表S1。

2.2 幼儿尿中PAEs代谢物暴露水平

2岁幼儿尿液肌酐校正后PAEs代谢物暴露水平分布情况如表1所示，MEP、MiBP、MEHHP、MEOHP、MECCP的检出率均为100%，其余5种PAEs代谢物的检出率范围为93.05%～99.70%。10种PAEs检出值的几何均值范围为0.80～157.82 μg·g-1（以肌酐计，下同）；CPAEs中位值及四分位数范围为3.05（1.54～6.25）μmol·g-1（以肌酐计，下同）。未经肌酐校正的PAEs 质量浓度见补充材料表S2。

表1 2岁幼儿尿液肌酐校正后PAEs代谢物检出量分布（n=331）Table 1 Distribution of creatinine-adjusted urinary PAEs metabolites concentrations in toddlers aged 2 years (n=331)

2.3 幼儿神经发育状况

2 岁幼儿Gesell 量表总DQ 平均分的±s为97.58±8.11，各能区DQ 评分见表2。按性别分层后，男、女童总DQ 平均分分别为97.19±8.18 和97.87±8.41；除男童应人能区DQ 评分低于女童外（P=0.003），其他能区DQ得分、总DQ 平均分以及神经发育迟缓率在男女童间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表2 2 岁幼儿的Gesell量表各能区DQ 评分情况（n=331）Table 2 Distribution of Gesell Development Schedule DQ scores in toddlers aged 2 years (n=331)

2.4 幼儿PAEs 暴露水平与神经发育指标的关联

校正潜在混杂因素后，广义线性模型分析PAEs暴露与神经发育指标之间关联的结果见表3，尿中MMP 经肌酐校正浓度分别与幼儿应物能区、应人能区和总DQ 平均分呈负相关，其关联系数b及其95%可信区间（CI）分别为-1.53（-2.77～-0.30）（P=0.015），-1.58（-2.86～-0.30）（P=0.015），-1.34（-2.53～-0.15）（P=0.027）；尿中MEHP 经肌酐校正浓度与幼儿动作能区及总DQ 平均分呈正相关，b（95%CI）分别为2.03（0.35～3.71）（P=0.018），1.51（0.04～2.96）（P=0.045）；其余尿中PAEs 代谢产物浓度与幼儿Gesell 量表各能区DQ 评分的关联均不具有统计学意义（P＞0.05）。广义相加模型显示仅MMP 与幼儿应人能区DQ 得分的关系呈非线性关系（P＜0.05），结果见补充材料图S1。

表3 2 岁幼儿尿液中经肌酐校正的PAEs 代谢物水平与Gesell量表各能区DQ评分的关联性分析Table 3 Associations between creatinine-adjusted urinary PAEs metabolites concentrations and Gesell Development Schedule DQ scores in 2-year-old toddlers

敏感性分析校正了同一尿样中BPA、OPs、Pb、Cd、Hg浓度及混杂因素，PAEs 代谢物浓度与神经发育指标的关联方向和强度未发现明显变化，结果见补充材料表S3。

性别分层分析发现，女童中（图1）观察到MMP分别与应物能区、应人能区以及总DQ平均分呈负相关（b=-1.94，95%CI：-3.81～-0.06，P=0.043；b=-2.80，95%CI：-4.73～-0.87，P=0.004；b=-1.88，95%CI：-3.69～-0.07，P=0.042）；而在男童中（图2）发现MEHP 分别与动作能区评分及总DQ 平均分呈正相关（b=3.17，95%CI：1.01～5.33，P=0.004；b=2.15，95%CI：0.24～4.07，P=0.027）。

图1 幼儿尿中MMP浓度与应物能区（A）、应人能区（B）DQ得分及总DQ平均分（C）关系的性别分层分析Figure 1 Associations of urinary MMP concentration with adaptive (A),personal-social (B),and total average (C) DQ scores in sex-stratified analysis

图2 幼儿尿中MEHP浓度与动作能区DQ得分（A）及总DQ平均分（B）的关系的性别分层分析Figure 2 Associations of urinary MEHP concentration with motor (A)and total average (B) DQ scores in sex-stratified analysis

3 讨论

PAEs具有内分泌干扰作用，与儿童注意缺陷多动障碍、神经发育迟缓有关［13］。本研究发现研究对象尿中PAEs代谢物普遍存在；幼儿尿中MMP浓度与应物、应人能区得分及总DQ平均分呈负相关，MEHP浓度与动作能区得分及总DQ 平均分呈正相关；性别分层分析结果表明女童尿中MMP 浓度与幼儿神经发育存在负向关联，而男童尿中MEHP 浓度与幼儿神经发育存在正向关联。

本研究2 岁幼儿尿液中10 种PAEs 代谢产物检出率为93.05%～100.00%，儿童尿肌酐校正CPAEs高于蔡秀秀等［14］于安徽马鞍山队列的研究结果。本研究幼儿尿中CLMWP水平高于CHMWP，这与Qian 等［15］对武汉2 岁幼儿检测结果一致。本研究幼儿尿LMWP 肌酐校正浓度高于台湾Ku等［16］同类研究结果；而HMWP肌酐校正浓度的中位值均低于该研究。课题组既往研究发现使用塑料奶瓶、塑料餐具可能会增加幼儿邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）与DEHP 的暴露水平［4］；而个人护理产品是邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）和DEP 的主要暴露源，占其总暴露量50%以上［17］。膳食途径是中国人群DEHP 暴露的主要来源，占DEHP 总暴露量的50%以上；而膳食途径仅占LMWP 总暴露量的10%以下［18］。LMWP 和HMWP应用范围和暴露途径不同，可能是造成以上研究差异的原因。

本研究观察到幼儿尿中MMP 浓度与儿童应物能区、应人能区和总DQ 评分存在负相关，性别分层结果观察到MMP 仅与女童存在上述关联。波兰的横断面研究发现7 岁儿童尿中MMP 浓度与优势与困难量表中总困难评分和数学能力评分存在正向关联；同时MMP 与智力与发展量表固定IQ 评分呈负相关，表明MMP 暴露可能与学龄儿童神经发育受损有关［19］。Dong等［20］的研究发现9月龄婴儿哺乳期MMP暴露仅为女婴沟通能力发育迟缓的危险因素，本研究结果与之一致。本研究还观察到幼儿尿中MEHP 浓度与儿童动作能区和总DQ 评分呈正相关；性别分层结果发现MEHP 仅与男童动作能区评分及DQ 平均分呈正相关。Qian 等［15］武汉2 岁幼儿研究观察到孕期MEHP 平均暴露水平也仅与男童贝利婴幼儿发育量表运动发展指数呈正相关；本研究结果与以上研究一致。LMWP与HMWP 诱导激活或调节PPAR 通路时效力不同［21］，此外，LMWP 与HMWP 的暴露来源及水平不同，也可能是MMP 与MEHP 对幼儿神经发育效应结果不一致的原因，但这些发现需要更多的流行病学证据证明。

PAEs作为环境内分泌干扰物，具有抗雄激素作用并可干扰甲状腺激素水平，而甲状腺激素和性类固醇激素在幼儿生命早期大脑发育起着关键作用［13］。动物实验表明，PAEs 抑制胚胎合成睾酮，使得下丘脑-垂体-性腺轴的组织和功能调节异常，且睾酮、雌二醇在哺乳动物受体通路存在性别差异［22］，DEHP 及其代谢产物MEHP 可以影响大鼠甲状腺素合成、调节和作用功能［5］。流行病学研究表明PAEs 暴露对儿童甲状腺功能影响具有性别差异，主要表现为在女童甲状腺素水平下降，而男童甲状腺素水平上升［9］。生命早期暴露于PAEs 会干扰海马功能与结构，进而影响幼儿内在行为［23］。以上机制学研究可能是PAEs 对幼儿神经发育影响具有性别差异的原因。

本次研究基于射阳小型出生队列研究，信息收集较为完整；采取的PAEs 代谢产物检测方法检出限较低，能够准确评估儿童尿中PAEs 的暴露负荷。敏感性分析排除了同期其他可能神经毒物的影响。但本研究依然存在一些局限性，首先，本研究设计仍属于横断面研究，因果关系推断能力受限，缺乏孕期PAEs 暴露数据，无法排除孕期PAEs 的长期影响作用；其次，PAEs 在体内快速代谢主要经尿液排出，生物半衰期较短［21］，尿中的PAEs 羟基化代谢产物常作为暴露的生物标志，研究表明普通人群在无生活方式改变的情况下，PAEs 的暴露水平一般处于一个相对稳定的状态，较大样本量可以减少暴露错分偏倚，但研究结论外推时需谨慎。

综上，本研究发现该农村地区2 岁幼儿体内PAEs类暴露普遍存在，MMP 与MEHP 暴露与Gesell 量表发展量表部分能区得分存在关联，且存在性别差异。研究结果为公共卫生政策和儿童卫生保健措施提供科学依据。在未来的研究中拟开展多中心、长时间的队列随访研究，拓展结论的外推性；增加影响儿童神经发育的影响因素调查，如膳食情况等；开展多污染物共暴露的研究，在共暴露模型中探究PAEs 类对儿童神经发育的影响。