孕期毒死蜱暴露水平与新生儿体格发育指标的关系

张博雅，许雨柔，张济明，郭剑秋，齐小娟，吕沈亮，常秀丽，邬春华，周志俊

复旦大学公共卫生学院/公共卫生安全教育部重点实验室，上海 200032

毒死蜱（又名乐斯本，chlorpyrifos，O，O-二乙基-O-［3，5，6-三氯-2-吡啶基］磷酸酯，CPF）是一种新型有机磷类农药，因其高效、杀虫谱广、持效期长等特点被广泛用于农业杀虫剂和除草剂，是全世界消费量第四高的农药［1］。随着CPF 的大量使用，环境中的CPF 污染问题逐渐引发关注，CPF 在水体中有较低的溶解度和较长的半衰期［2］，因此常在土壤、蔬菜及水果等表面富集并残留，造成环境污染问题［3］。生物监测研究表明，包括孕妇和儿童在内的非职业人群普遍暴露于CPF，主要途径为摄入受污染的食物［4］。我国于2016年禁止毒死蜱用于蔬菜种植［5］，但由于其有效、便利、低成本等优势，仍在全球范围保持较高的市场份额［6］。CPF 在体内代谢迅速，一项人体志愿者研究表明口服给药后CPF 代谢物尿二烷基磷酸酯的表观消除半衰期为15.5 h，而皮肤给药后为30 h［7］。特异性代谢产物3，5，6-三氯-2-吡啶醇（3，5，6-trichloro-2-pyridinol，TCPy）经尿液排出体外，尿液中的TCPy 水平可作为CPF 的暴露标志应用于生物监测工作［8］。

近年来随着CPF 相关研究的逐渐深入，其神经毒性、环境内分泌干扰作用等不良健康效应也逐渐受到重视［9］。胎儿期是器官发育的重要阶段，宫内发育水平可影响一生的健康，然而目前国内有关孕期CPF 暴露与出生结局相关的人群研究较为有限［10］，国外多项关于孕期CPF 暴露与新生儿体格指标（包括出生体重、出生身长和头围）之间关联的流行病学研究回顾中表明，不同研究中可能由于暴露水平、暴露时间及数据采集时间不同，CPF 暴露的生物标志物与体格指标之间并未存在一致、显著的关联［11］。前期研究已报道了射阳小型出生队列人群CPF 暴露水平及影响因素［12］，本研究基于队列基础，分析孕妇尿样中TCPy浓度与新生儿体格发育指标的关联。

1 对象与方法

1.1 研究对象

射阳小型出生队列自2009年6月15日至2010年1月20日在江苏省射阳县纳入1 303 名孕妇及其所分娩的新生儿［13］。本研究所采用的数据取自该队列数据库。排除尿样不足或缺失、出生结局数据缺失、问卷信息缺失、双胞胎、严重出生缺陷者，共1 100 对母子纳入本研究。所有研究对象（监护人）同意参加并签署知情同意书。本研究已通过复旦大学公共卫生学院医学研究伦理委员会审查和批准（编号：IRB#2021-02-0875）。

1.2 新生儿体格检查

新生儿在当地妇产科医院娩出后，由专业助产人员测量身长、头围和出生体重，并计算新生儿的体重指数（body mass index，BMI）和重量指数（ponderal index，PI，体重以g 计，身长以cm 计），计算公式为：IBMI=体重/身长2（kg·m-2），IPI=100×体重/身长3（g·cm-3）。BMI 和PI 均为反映新生儿身体匀称性的临床指标，两者均在相关研究中应用于评估新生儿营养状况［14］。新生儿的出生体重等于或大于4 000 g 者定义为巨大儿［15］。

1.3 尿样采集及检验

采集孕妇分娩前尿液50 mL置于聚丙烯冻存管中，置于-20℃冰箱冻存，并于1周内低温转运至-80℃冰箱内保存。尿样中TCPy 测定采用本课题组建立的尿样中酚类化合物气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS/MS）检测方法［16］，样品制备过程包括：酸化水解、液液萃取、硅胶SPE 柱洗脱净化以及N，O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺［N，O-Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA］衍生化处理。完成上述预处理过程后进行GC-MS/MS 分析，TCPy 质量浓度（简称浓度）的方法定量限为0.10 μg·L-1，加标回收率为99%～102%，日间精密度小于11%。

采用除蛋白法肌酐试剂盒（南京建成，中国）和ELx800酶标仪（BIO-TEK，美国）测定尿样中肌酐浓度。

1.4 统计学分析

采用均值±标准差描述连续性资料的变量特征，分类资料采用例数（构成比）描述。新生儿身长（n=1 089）、头围（n=1 060）、BMI（n=1 088）和PI（n=1 088）存在少量数据缺失。TCPy 浓度经肌酐校正和对数转换后服从正态分布，作为自变量纳入各统计模型。采用Spearman 检验分析新生儿体格指标与孕妇尿样TCPy浓度间的联系，采用Mann-WhitneyU秩和检验分析巨大儿/非巨大儿与尿样TCPy 浓度间的联系。应用广义线性模型以新生儿出生时的身长、体重、头围、BMI、PI 和巨大儿为应变量分析CPF 暴露水平对新生儿体格指标的影响，将孕妇年龄（岁）、孕前BMI（kg·m-2）、孕期增重（kg）、孕周（周）、受教育程度（初中及以下/高中及以上）、孕期被动吸烟情况（是/否）、家庭年收入（30 000 元及以上/30 000 元以下）、新生儿性别（男/女）作为协变量纳入分析模型。因毒死蜱等有机磷类农药所具有的环境内分泌干扰作用多具有性别差异［17］，模型中纳入TCPy 与性别的交互项以检验孕期母亲尿中TCPy 浓度与新生儿体格指标的关联是否存在性别差异，同时按性别分层分别研究不同性别之间CPF 暴露水平对体格指标影响的差异。数据分析采用SPSS 25.0 软件（IBM，美国），所有检验均为双侧检验，除性别交互项检验水准α=0.10 外，其余检验水准均为α=0.05。

2 结果

2.1 研究对象的特征

1 100 例孕妇年龄为（26.06±5.42）岁，孕前BMI为（21.40±2.78）kg·m-2。63.9%孕妇为初中及以下学历，48.7%的孕妇所在家庭环境存在被动吸烟，54.3%的家庭年收入大于30 000 元。86.0%的新生儿为首产，分娩方式中剖宫产占64.4%，新生儿的出生体重、身长、头围、BMI、PI 分别为（3 490.49±442.57）g、（51.23±2.35）cm、（34.64±1.45）cm、（13.29±1.41）kg·m-2、（2.60±0.32）g·cm-3。巨大儿共137例，占新生儿总数的12.5%。

2.2 孕妇尿中TCPy浓度水平

先前本课题组研究中已报道研究人群尿中TCPy浓度及影响因素［12］，本研究纳入的1 100 份孕晚期尿液样品中，100%检出TCPy，肌酐校正浓度范围为0.14～135.44 μg·g-1（以肌酐计，后同），中位值6.96 μg·g-1，四分位区间（4.35，11.76）μg·g-1，几何均值7.02 μg·g-1。

2.3 孕妇尿TCPy 浓度与新生儿体格指标间的关系

如表1所示，尿样中TCPy 浓度与新生儿出生体重（P=0.001）、头围（P=0.004）、BMI（P＜0.001）、PI（P＜0.001）呈正相关；经肌酐校正后TCPy 浓度仅与新生儿的BMI（P=0.002）和PI（P＜0.001）呈正相关，而与出生体重、身长、头围和巨大儿发生之间的相关无统计学意义。

表1 孕妇尿TCPy浓度与新生儿体格发育指标间的Spearman相关分析Table 1 Spearman correlation between TCPy levels in urine samples of pregnant women and neonatal anthropometric indices

如表2所示，广义线性模型结果表明，孕妇尿中TCPy 浓度水平与新生儿BMI［回归系数b及其95%CI为0.270（0.053～0.486），P=0.015］、PI［b（95%CI）为0.062（0.012～0.112），P=0.016］呈正相关，而与出生体重、身长、头围及巨大儿发生的相关均无统计学意义。各模型加入性别交互项后，身长（P=0.088）、BMI（P=0.033）、PI（P=0.013）模型的性别交互项有统计学意义（α=0.10）。性别分层后，男性新生儿模型中TCPy 浓度水平与BMI 呈正相关［b（95%CI）为0.443（0.138～0.748），P=0.004］，与PI 也呈正相关［b（95%CI）为0.111（0.043～0.179），P=0.001］；而在女性新生儿中并未观察到孕期TCPy 浓度水平与出生体重、身长、头围、BMI、PI 及巨大儿发生之间的相关有统计学意义。

表2 孕期CPF 暴露水平与新生儿体格发育指标间的广义线性模型分析结果（n=1 099）Table 2 The results of generalized linear model of CPF exposure levels during pregnancy and neonatal anthropometric indices (n=1 099)

3 讨论

本研究基于射阳小型出生队列，以GC-MS/MS 测定孕妇尿样中有机磷类农药CPF 的特异性代谢产物TCPy浓度水平，分析其与新生儿体格发育指标间的关系，发现孕妇孕期尿TCPy 浓度与新生儿BMI 和PI 的正相关结果在男女性新生儿中存在差异。

本研究孕妇尿中全部检出TCPy，表明研究地区孕妇普遍暴露于CPF 农药。与国外同类研究相比，本研究地区孕期尿样TCPy 检出率（100%）和负荷水平［中位值（M）6.96 μg·g-1，几何均值（GM）7.02 μg·g-1］高于孟加拉国［97.9%，GM（3.17 μg·g-1）］［18］、丹麦［90.4%，M（1.61 μg·L-1）］［19］和美国波多黎各［81.4%，M（3.2 μg·L-1）］［20］，这可能与不同地区的孕妇生活方式、居住环境等不同，以及各地环境中CPF 污染情况以及相关规定不同有关。

本研究发现射阳小型出生队列孕妇孕期CPF 暴露水平与新生儿BMI 和PI 呈正相关，提示孕期CPF 暴露可能影响宫内发育过程。毒死蜱等有机磷农药可通过抑制胆碱酯酶，提高乙酰胆碱对子宫收缩的刺激作用，影响宫内发育过程［21］。动物实验中发现怀孕小鼠CPF暴露引起子代COX2基因与相关蛋白表达上升［22］，进而影响胎儿内分泌调节的机制，促进胎儿生长发育［23］。亦有报道CPF 及TCPy 可以促进分化的3T3-L1 前脂肪细胞的数量增加，脂质滴储存能力增强，进而促进脂肪形成过程［24］。

多项人群流行病学研究探讨了孕期CPF 暴露可能对新生儿体格发育有影响，但结果并不一致。Wohlfahrt-Veje 等［25］在对欧洲人群的研究中报道妇女在孕早期CPF 等农药暴露会导致新生儿的出生体重和胎龄体重明显降低。Zhao 等［26］报道了相似的结果，纽约研究人群中孕妇暴露CPF 水平与新生儿BMI 负相关，但与PI 关联无统计学意义；而本研究中CPF 暴露与婴儿出生体重无关联，但与BMI、PI均呈正相关。有研究表明脐带血浆中CPF 水平与出生体重和身长之间呈负相关［27-28］，但欧登塞儿童队列（OCC）并未观察到母亲尿样中TCPy 等农药代谢产物的浓度与新生儿出生指标间的关联［29］。本研究结果与上述研究不尽相同，可能与不同研究在队列人群、暴露水平、研究设计、样本量及地域人种等因素的差异有关。

本研究发现TCPy 水平与性别交互项在以身长、PI和BMI 为应变量的广义线性模型中有统计学意义，且相关结果在性别分层模型中存在差异，这一结果提示CPF 宫内暴露的健康效应可能存在性别差异。Guo 和De Felice 等［30-31］均报道了男孩对孕期CPF 暴露更为敏感。近年来研究表明有机磷农药可通过干扰性激素合成，影响下丘脑-垂体-性腺轴等机制诱导生殖毒性，具体表现为类雌激素/抗雄激素效应［32］，这可能可以解释CPF 暴露对新生儿的影响存在一定的性别差异，在男孩中暴露水平与PI和BMI的相关性比女孩更加显著。此外，Lassiter等［33］发现在宫内暴露于CPF的子代雄性大鼠断奶后出现体重增加并具有统计学意义，而子代雌性大鼠的体重并无统计学差异，提示产前CPF暴露在导致子代肥胖中存在性别差异，与本研究结果一致。

本研究以队列随访人群为基础，以较大的样本量评估孕期CPF 暴露与新生儿出生结局的相关性，先进的GC-MS/MS 方法实现了测定孕妇尿样中TCPy 水平的高检出率，为应用广义线性模型探究孕期CPF 暴露水平与出生结局间的关系奠定了基础。但本研究仍存在局限性，单一的研究地点限制了研究结果的外推，CPF 较短的半衰期使采用单点尿样评估暴露水平的方法存在暴露错分的风险。

综上所述，孕期CPF 暴露与新生儿体格发育指标存在关联，CPF 水平与新生儿BMI、PI 呈正相关，性别分层后在男孩中发现与BMI 及PI 存在正向关联，而与女孩并无明显的相关性。本研究及国内外研究结果可为我国毒死蜱健康风险评估及农药使用制度的制定提供一定的依据，基于宫内CPF 暴露对儿童健康的不良影响，建议监管部门加强对农药环境暴露及食品残留的管控力度，加强宣教，提高孕妇的防护意识，从而保障胎儿的健康成长。