固定化菌剂制备及对油田措施废液残渣的处理*

孙先锋 柴晓蝶 赵 敏 任 鹏 吴蔓莉 肖宇婷

(1.西安工程大学环境与化学工程学院，陕西 西安 710048；2.长庆油田分公司油气工艺研究院，陕西 西安 710018；3.西安建筑科技大学环境与市政工程学院，陕西 西安 710055)

油田措施废液残渣是油田开发过程中油水井作业后产生的废液经污水站压滤、离心等处理后得到的废渣[1-2]，成分复杂，性质特殊，处理技术难度大，成本高，目前还没有经济可行的处理技术。因废渣含有大量原油成分，郭蒲[3]采用污油泥的处理工艺对其进行处理，处理后的废渣含油量小于5%(质量分数，下同)，原油的回收率达到90%。因此，可在含油污泥处理方法基础上进行适应性优化研究，将其应用于油田措施废液残渣的处理。

目前可用于含油污泥处理的方法中，生物法以成本低、投资少、不易产生二次污染的独特优势被广泛应用[4]。采用固定化技术制备微生物菌剂解决环境污染问题已成为生物法的发展趋势[5]。固定化微生物菌剂具有独立的微环境，可有效屏蔽土著菌的竞争及外界不利因素的影响，它以独特的优势被广泛应用于石油污染土壤的生物处理[6-7]。

制备微生物固定化菌剂，载体应符合无毒性、成本低、可生物降解、含营养物质和传质性能好等要求。随着农业废弃物的增多，国内外研究者逐渐倾向于利用农业废弃物、农副产品以及由此制备的生物炭作为固定化载体[8]，目前使用作物秸秆为载体固定微生物进行石油污染土壤处理的研究较多[9-11]，[12]2710，但还未出现利用麸皮及麸皮炭作为固定化载体的研究，有研究表明小麦加工后的副产物麸皮含有极其丰富的营养物质，且来源广，蓄积量大，价格低廉，具有广阔的应用前景[13]。因此本研究分别以麸皮及麸皮炭为载体，制备固定化原油降解菌剂，并研究固定化菌剂对油田措施废液残渣的处理效果，以期为油田措施废液残渣规模化无害化处理提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

原油降解培养基：原油5.0 g/L，NH4NO32.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，无水CaCl20.02 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.1.2 实验菌种

经分离筛选和驯化得到4株菌，编号分别为：J2、J4、J5、Ba-6，互不拮抗。

高效原油降解菌株：J2为动胶菌属(Zooqloeasp.)，J4为黄单胞菌属(Xanthomonassp．)，J5为葡萄球菌属(Staphylococcussp.)。

产表面活性剂菌株：Ba-6为假单胞菌属(Pseudomonassp.)。

1.1.3 油田措施废液残渣样品

油田措施废液残渣样品采自长庆油田某措施废液集中处理站。

1.1.4 载体材料

麸皮：采购自延安市某面粉厂，无杂质，无霉变，含水率≤10%，粉碎后过80目筛。

麸皮炭：用蒸馏水将麸皮清洗一遍，60 ℃热风烘干后粉碎机粉碎，置于坩埚中，马弗炉300 ℃热解4 h，研磨并过80目筛，制成生物炭[14]。

1.2 实验方法

1.2.1 样品基本理化性质

观察油田措施废液残渣样品的外观形态、颜色及气味；将油田措施废液残渣样品自然风干后置于110 ℃烘箱中烘干至恒重，玛瑙研钵磨碎，过80目筛，测定其基本理化性质，方法见表1。

表1 样品基本理化性质测定方法

1.2.2 混合菌液的制备

挑取J2、J4、J5和Ba-6 4株菌单菌落分别接种于100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，35 ℃、160 r/min条件下振荡培养24 h，制备菌悬液(600 nm的吸光度(OD600)= 0.5)。将4种菌悬液按照前期实验确定的最佳接种比例(1.50∶0.50∶0.75∶1.50，质量比)配制成混合菌液。

1.2.3 固定化菌剂的制备

采用吸附法制备固定化菌剂[15]342。分别以麸皮和麸皮炭为固定化载体，准确称取3.0 g载体添加到100 mL牛肉膏蛋白胨培养基中，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后接入20 mL混合菌液，35 ℃、160 r/min条件下振荡固定24 h。固定结束后于4 000 r/min条件下离心10 min，弃去上清液，用生理盐水洗涤沉淀物后离心，重复洗涤2～3次，离心所得沉淀物即为麸皮固定化菌剂和麸皮炭固定化菌剂，室温下干燥保存备用。

1.2.4 液体环境原油降解实验

设计3组实验，分别为：

(1) 称取以麸皮和麸皮炭制备的固定化菌剂各3.0 g分别加入到100 mL原油降解培养基中。

(2) 称取已灭菌麸皮和麸皮炭各3.0 g分别与20 mL混合菌液混匀，制成载体与混合菌液的简单混合物，分别加入到100 mL原油降解培养基中。

(3) 取20 mL混合菌液加入到100 mL原油降解培养基中。

将上述3组实验于35 ℃、160 r/min条件下振荡培养5 d，采用红外测油仪(OIL460)检测含油率[16]，计算原油降解率。

1.2.5 固定化条件优化

以麸皮、麸皮炭为固定化载体，改变载体添加量(2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g)、固定化温度(20、25、30、35、40、45 ℃)、固定化时间(12、18、24、30、36、40 h)等条件制备固定化菌剂，当改变其中某个条件时，其他操作同1.2.3节。取两种固定化菌剂各3.0 g分别接入100 mL 原油降解培养基中，35 ℃、160 r/min振荡培养5 d，测定含油率，对比降解效果。

1.2.6 固定化菌剂对油田措施废液残渣的处理实验

称取两组100 g油田措施废液残渣样品于24 cm×17 cm×7 cm(长×宽×高)规格的塑料盒中，一组添加质量分数5%的麸皮固定化菌剂，另一组添加质量分数5%的麸皮炭固定化菌剂，混合均匀，置于35 ℃培养箱中，期间翻动土壤保持通氧量，定期喷洒无菌水使含水率保持在20%～30%[17]，以不添加任何菌剂的油田措施废液残渣为空白对照组，每7天取一次样，测定含油率。

采用氯代三苯基四氮唑(TTC)-分光光度法测定脱氢酶活性[18]。采用平板计数法[19]测定微生物总数。

1.2.7 油田措施废液残渣处理前后原油组分分析

采用气相色谱(GC)—质谱(MS)分析油田措施废液残渣处理前后原油组分的变化。

烷烃参数设定：HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；进样口温度300 ℃，进样量1 μL，不分流进样，载气流量1 mL/min。升温程序：初始温度50 ℃，保持5 min；以20 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。

多环芳烃参数设定：HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；进样口温度300 ℃，进样量1 μL，不分流进样，载气流量1.2 mL/min。升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至300 ℃。

2 结果与讨论

2.1 样品基本理化性质

检测处理后样品各项基本理化指标，结果见表2。

表2 油田措施废液残渣与洁净土壤基本理化性质

通过观察发现，油田措施废液残渣样品呈黑色黏状固态，带有恶臭气味，让人明显感觉不适，与洁净土壤差异明显，原因是残渣中含有原油成分及一些厌氧发酵沉渣，使得残渣外观属性发生变化。由表2可知，油田措施废液残渣偏弱碱性，含水率适中，较高的含油率导致有机质含量偏高。

2.2 液体环境下原油降解效果评价

按照1.2.4节中的实验安排，分别开展了以麸皮、麸皮炭制备的两种固定化菌剂，混合菌液，以麸皮、麸皮炭与混合菌液制成的两种简单混合物对原油的降解实验研究，结果见图1。

图1 固定化菌剂、混合菌液及载体与混合菌液的简单混合物对原油的降解效果Fig.1 Degradation effects of crude oil by immobilized bacteria,mixed bacterial liquid and carrier-mixed bacterial liquid

由图1可知，麸皮和麸皮炭制备的两种固定化菌剂对原油的降解效果优于混合菌液，也优于两种载体与混合菌液的简单混合物。麸皮炭固定化菌剂对原油的降解率最高，达到91.65%，相比混合菌液降解率提高了38.07%，其次是麸皮固定化菌剂，降解率达85.82%，相比混合菌液提高了29.29%。这是由于固定化菌剂中含有大量原油降解微生物，且载体能够吸附原油，将原油有效分散，有助于微生物对原油的高效利用。麸皮炭的表面粗糙，更有利于吸附菌体[15]341,[20]，因此其固定化菌剂对原油的降解效果优于麸皮固定化菌剂。载体与混合菌液的简单混合物中游离菌偏多，载体吸附大量原油时，不利于游离菌对原油的利用[12]2710。

2.3 载体添加量对原油降解率的影响

制备固定化菌剂时，载体的添加量影响微生物负载量，从而影响固定化菌剂对原油的降解效果。载体添加量对原油降解效果的影响见图2。

图2 载体添加量对原油降解率的影响Fig.2 The effect of carrier addition on crude oil degradation rate

由图2可知，麸皮炭固定化菌剂的原油降解率均高于麸皮固定化菌剂，载体添加量为4.0 g时，麸皮炭固定化菌剂与麸皮固定化菌剂的原油降解率达到最大，分别为94.02%、90.68%，当添加量低于或高于4.0 g时，两种固定化菌剂的原油降解率均减小。载体添加量较少时，载体吸附微生物的比表面积小，单位质量的载体附着的微生物密度过大，种群之间会争夺营养物质，阻碍菌体进一步生长繁殖，对降解效果不利；当载体添加量不断增加，单位质量载体吸附的微生物数量减少，难以保证降解菌体数量充足，导致降解能力下降。因此，制备麸皮固定化菌剂和麸皮炭固定化菌剂的载体最佳添加量为4.0 g。

2.4 固定化时间对原油降解率的影响

固定化菌剂制备过程中，固定化时间会影响微生物吸附效果，进而对固定化菌剂的原油降解性能产生影响。采用不同固定化时间制备的固定化菌剂对原油降解效果的影响见图3。

图3 不同固定化时间对原油降解率的影响Fig.3 The effect of different immobilization time on crude oil degradation rate

由图3可知，随着固定化时间的延长，麸皮固定化菌剂和麸皮炭固定化菌剂的原油降解率均呈现先上升后下降的趋势，当固定化时间为30 h，麸皮固定化菌剂与麸皮炭固定化菌剂的原油降解率达到最高，分别为91.47%和95.29%。固定化时间不足30 h时，微生物难以充分及牢固地吸附在载体上，使得单位质量固定化菌剂中菌体数量较少。当固定化时间超过30 h后，载体对微生物的吸附达到了相对饱和，氧气和养分的限制及菌体的浓度过高，导致菌体开始衰亡解体，降解活性下降，出现了微生物脱附现象，原油降解率也随之降低。因此，选择30 h作为最佳的固定化时间。

2.5 固定化温度对原油降解率的影响

固定化菌剂对原油的降解主要借助酶催化来完成，而酶活性对温度敏感，因此温度对固定化菌剂降解活性至关重要[21]。不同固定化温度对固定化菌剂的原油降解效果影响见图4。

图4 不同固定化温度对原油降解率的影响Fig.4 The effect of different immobilization temperature on crude oil degradation rate

由图4可知，随着固定化温度的升高，麸皮固定化菌剂和麸皮炭固定化菌剂对原油降解率均呈现先升高后下降的趋势，当固定化温度为35 ℃时，麸皮固定化菌剂和麸皮炭固定化菌剂对原油的降解效果最好，降解率分别为92.32%、95.70%，此时酶活性保持最高，微生物生长代谢旺盛，促进了微生物对原油的利用。当温度低于或高于35 ℃，原油降解率都处于下降趋势，这是由于温度不合适时酶活性低，微生物生长代谢减弱，从而影响固定化菌剂对原油的降解效果。因此制备固定化菌剂的最佳固定化温度为35 ℃。

2.6 固定化菌剂对油田措施废液残渣的处理效果

2.6.1 处理过程中含油率的变化

以不添加任何菌剂的油田措施废液残渣为空白对照，以麸皮和麸皮炭制备的两种固定化菌剂对油田措施废液残渣处理过程中含油率的变化见图5。

图5 处理过程中含油率的变化Fig.5 The change of oil content during the disposal process

由图5可知，即使不添加任何菌剂，油田措施废液残渣含油率也有一定下降，经过63 d的处理，最终原油降解率为16.18%，这种下降是残渣中存在的土著微生物对原油产生了一定的降解，以及轻质原油的挥发引起的。

添加了固定化菌剂的两组处理的含油率出现了显著下降，且呈现3个阶段。第1阶段是0～7 d，麸皮固定化菌剂与麸皮炭固定化菌剂的原油降解率增长缓慢，油田措施废液残渣处理效果不佳，降解率均未超过5%，原因是降解微生物处于环境适应期，生长缓慢，代谢率低，对原油的利用少；第2阶段是7～49 d，微生物逐渐适应环境，碳源等营养物质丰富，微生物迅速生长繁殖，对原油的需求增加，残渣含油率也迅速降低。49 d测定得麸皮固定化菌剂与麸皮炭固定化菌剂的原油降解率分别为85.38%、89.65%，含油率分别降至1.96%、1.39%；第3阶段是49～63 d，营养物质逐渐耗尽，原油中易于降解的烷烃类物质基本被利用，营养物质的缺乏导致微生物生长受到限制，从而使代谢率降低。最终，麸皮固定化菌剂与麸皮炭固定化菌剂的原油降解率趋于平稳。

2.6.2 处理过程中微生物数量的变化

降解微生物的数量可以反映出微生物对环境的适应能力及生长状况，对处理效果具有重要影响，可以间接表征石油污染物的降解程度。油田措施废液残渣在63 d的处理过程中微生物数量的变化见图6。

由图6可知，添加了固定化菌剂的两个处理微生物数量显著高于空白对照，两组处理在处理油田措施废液残渣过程中微生物数量呈现先增加后减少的趋势。1～7 d，微生物数量增加缓慢，这是由于此时微生物正处于环境适应期，生长代谢缓慢；7 d后，微生物逐渐适应环境，碳源等营养物质丰富，微生物数量呈指数级增加；当处理至28 d时，麸皮炭固定化菌剂处理的油田措施废液残渣中微生物数量达到最大，为1.773×108cfu/g；麸皮固定化菌剂处理的油田措施废液残渣微生物数量在处理至35 d时达到最大，为1.456×108cfu/g；处理后期，微生物数量逐渐减少，这是由于碳源等营养物质不断被消耗，微生物生长受到限制，出现衰亡现象。空白对照在整个处理期间微生物数量变化不大，维持在较低的水平。

图6 处理过程中微生物数量的变化Fig.6 The change of microbial quantity during the disposal process

2.6.3 处理过程中脱氢酶活性的变化

在油田措施废液残渣处理体系中，微生物能够以原油作为碳源，主要是依靠酶的催化作用。脱氢酶的活性可以间接反映处理体系中微生物的量及其对有机物的降解能力。油田措施废液残渣在63 d的处理过程中脱氢酶活性的变化见图7。

图7 处理过程中脱氢酶活性的变化Fig.7 The change of dehydrogenase activity during the disposal process

由图7可知，空白对照的脱氢酶活性变化不大，维持在较低的水平。不同处理中脱氢酶活性呈现出一个动态变化。脱氢酶活性的变化与微生物数量有关。初期，油田措施废液残渣中营养丰富，微生物生长繁殖快，脱氢酶活性高；处理至28 d，以麸皮炭固定化菌剂处理的油田措施废液残渣中脱氢酶活性达到最高，为59.22 U/g；处理至35 d，麸皮固定化菌剂处理的油田措施废液残渣中脱氢酶活性达到最高，为52.48 U/g；后期，脱氢酶活性下降，是由于在处理过程中随着碳源等营养物质的不断减少，微生物数量减少。

2.6.4 处理过程中原油组分的变化

为探讨两种固定化菌剂对原油不同组分的降解规律，分析了油田措施废液残渣在处理前后烷烃及多环芳烃含量变化，结果见图8和图9。

图8 处理前后烷烃质量分数的变化Fig.8 The change of alkane mass fraction before and after disposal

图9 处理前后多环芳烃质量分数的变化Fig.9 The change of polycyclic aromatic hydrocarbon mass fraction before and after disposal

由图8可知，与空白对照相比，麸皮固定化菌剂与麸皮炭固定化菌剂对油田措施废液残渣中烷烃的降解效果明显。残渣中的烷烃主要为C13～C31，C13以下的烷烃易挥发，不易直接检测到。其中C17～C27质量分数占总烷烃的75%以上。根据其物理性质划分标准，C17及以下为低碳烷烃，C17以上为高碳烷烃。由图8可见，油田措施废液残渣样品中的烷烃以高碳烷烃为主。经麸皮固定化菌剂和麸皮炭固定化菌剂处理后，烷烃的质量分数大幅度下降，其中C13、C14烷烃被完全降解，低碳烷烃降解率分别达95.35%和96.16%，高碳烷烃降解率分别达82.52%和86.24%，这表明两种固定化菌剂对油田措施废液残渣中不同碳链组分均能有效降解，显示出较大的碳链利用范围。

综上可知，采用麸皮和麸皮炭制成的固定化菌剂对油田措施废液残渣具有良好的处理能力，麸皮和麸皮炭为载体的固定化菌剂在63 d的处理周期内，原油降解率分别可达85.38%、89.65%。

3 结 论

(1) 液体环境中，麸皮炭固定化菌剂的原油降解率为91.65%，麸皮固定化菌的原油降解率为85.82%，与未固定化的混合菌液相比，原油降解率均提高30%左右。

(2) 以麸皮和麸皮炭为载体制备固定化菌剂的最佳条件为：载体添加量4.0 g，固定化时间30 h，固定化温度35 ℃。优化后的麸皮固定化菌剂和麸皮炭固定化菌剂的原油降解率分别可达92.32%、95.70%。

(3) 为期63 d的固定化菌剂对油田措施废液残渣处理过程中，含油率在7～49 d快速下降，之后基本不再降低，麸皮炭固定化菌剂的原油降解率可达89.65%，麸皮固定化菌剂的原油降解率可达85.38%，且两种固定化菌剂均能有效降解不同链长烷烃及不同环数多环芳烃，显示出较大的石油烃利用范围。