福建地区类孟买血型血清学特点及其基因突变分析

张爱，林洪铿，何觅，褚晓凌

(福建省血液中心检验科,福州350004)

类孟买血型为罕见的红细胞血型，属于H血型系统，主要特征为红细胞上H抗原缺失，而分泌液中可以检测到少量H抗原[1]。H抗原是A、B抗原形成的前体物质，H抗原缺失，可导致A、B抗原合成障碍，最终使得ABO血型鉴定错误和输血困难，因此在输血实践中具有重要意义。我们在无偿献血人群中发现10例类孟买血型，在常规血清学方法鉴定的基础上，同时采用直接测序技术对这10例样品的ABO基因、FUT1基因和FUT2基因进行测序分析。

1 对象与方法

1.1研究对象 2018年3月至2019年11月因常规ABO血型鉴定时出现反定型细胞凝集异常而进一步检测、鉴定为类孟买血型的10例献血者，其中8例来自本中心，2例来自省内其他血站。献血者中男性4例，女性6例，年龄18～40岁，籍贯均为福建省，每位献血者留取EDTA-K2抗凝血5 mL。

1.2主要仪器与试剂 PE9600PCR扩增仪(美国Applied Bio-system公司)，KA-2200型离心机(日本株式会社久保田制作所)。单克隆抗A、抗B、抗H、筛选细胞及谱细胞(上海血液生物医药公司)，试剂红细胞A、B及O(北京金豪制药公司)，抗AB(法国Diagast公司)，单克隆抗Lea、抗Leb(英国Millipore公司)，人源多克隆抗A、抗B血清(中国医学科学院输血研究所)，基因组DNA纯化试剂盒(德国Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1血型血清学检测 对10例样品行试管法ABO正、反定型及H抗原检测，采用人源抗A、抗B进行吸收放散试验，检测红细胞表面弱表达的A、B抗原，用试剂红细胞筛选和鉴定血清中的不规则抗体。通过检测Lewis血型间接了解个体的分泌状态。以上试验均严格按照《全国临床检验操作规程》[2]和相应试剂盒说明书进行。

1.3.2DNA提取 按照Qiagen DNA Min Blood试剂盒说明书提取样品基因组DNA，经紫外分光光度计检测，DNA纯度(A260 nm/A280 nm)为1.7～1.9。

1.3.3ABO、FUT1和FUT2基因扩增和测序分析 参照文献[3]针对ABO基因第6、7外显子进行扩增。引物5′-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3′、5′-CGGGATCCATGTGGGGTGGCACCCTGCCA-3′，用于扩增第6外显子，片段长度252 bp。引物5′-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3′、5′-CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3′，用于扩增第7外显子，片段长度843 bp。参照Yip等[4]报道的2对引物分别扩增FUT1基因第4外显子和FUT2基因第2 外显子，Hi7F1：5′-CATTTGCTAATTCGCCTTTCCTC-3′,Hi8R1：5′-GATCAGGCTACATCAGAAAGTCTCC-3′；Sei1F1：5′-CCATCTCCCAGCTAACGTGTCC-3′,See1R7：5′-GGGAGGCAGAGAAGGAGAAAAGG-3′。引物对Hi7F1和Hi8R1为扩增长度1 163 bp的FUT1基因蛋白编码区，引物对Sei1F1和See1R1为扩增长度1 118 bp 的FUT2基因蛋白编码区。引物由上海生工公司合成，PCR扩增产物由上海捷瑞生物公司测序。用Chromas2.23软件分析测序结果及峰图，用DANMAN5.22软件将测定序列与NM020469(A101)、M35531(FUT1)和U17894(FUT2)的序列比对。

2 结果

2.1血型血清学结果 见表1。10例样品中，Amh5例，Bmh2例，Omh3例，吸收放散试验证实红细胞表面含有少量的A或B抗原。除7号样品外，其余样品与谱细胞(10人份)反应均阳性，且强度一致，而与缺乏H抗原的红细胞不凝集，提示血清中含有抗H 或抗HI，仅5号样品在37 ℃中有极弱活性。Lewis血型均为Le(a-b+),证实10例样品均为分泌型。

表1 10例类孟买血型样品的血清学试验结果

2.2ABO、FUT1和FUT2基因分析结果 10例样品的ABO基因测序结果见表2。ABO基因测序结果与血清学吸收放散检测结果相吻合。通过对FUT1基因的DNA序列分析，在10例样品中检测到4种无效等位基因，分别为：h1(547-552delAG)、h2(880-882delTT)、h3(658C>T)和h9(424C>T)(表2)。其中h1/h13例、h3/h13例、h1/h22例、h2/h2和h1/h9各1例。所有被研究样品的FUT2基因，都具有357C>T的同义突变。样品3、8和10在nt716位存在G>A的错义突变，导致239位氨基酸由精氨酸(Arg)突变为谷氨酰胺(Gln)，其中2例为杂合子，1例为纯合子。FUT1和FUT2基因测序结果见图1。

表2 10例类孟买血型样品的分子生物学分析结果

注：A，样品1、4和 5 FUT1基因测序结果；B，样品3、8 FUT1基因测序结果； C，样品10 FUT1基因测序结果； D，样品2、6和7 FUT1基因测序结果； E，样品9 FUT1基因测序结果；箭头指示的碱基为突变碱基。

3 讨论

类孟买血型是因红细胞上H抗原缺乏而使ABO血型物质不能正常合成的一类血型，其最具特点的是红细胞上ABH缺乏或弱表达，血清中存在抗H或抗HI抗体。类孟买血型具有明显的遗传异质性和区域性，其表型频率在不同种族和群体中有较大差异，欧洲白种人群频率极低，约为1∶1 000 000；印度人群约为1∶10 000；泰国人群估计频率为1∶5 000；而我国不同区域人群中分布比例约为1∶8 000～1∶16 000[1，5-6]。

类孟买血型不属于ABO血型系统，却可造成ABO血型的异常表现。本研究中10例样品常规血清学试验正定型均为O型，反定型出现凝集强度(和/或状态)的异常。样品1～3表现为典型正、反定型相符的O型，但与O细胞出现不同强度的凝集，从表面上看似乎为O型，存在不规则抗体，在临床工作中易被误认为是无法鉴定的高频抗体而漏检；样品4～10，单从“反应”与“不反应”角度看，正、反定型相符，但反定型中与A细胞和B细胞之间凝集强度差异>2+，易被误认为是O型抗A(或B)抗体减弱而漏检。因此，在常规ABO血型定型时，对于正、反定型凝集异常的个体应补充相关红细胞抗原检测、吸收放散试验、唾液中和试验，甚至基因检测等。本研究采集的10例样品，经进一步血清学试验鉴定为类孟买血型。鉴于类孟买血型的稀有性和鉴定的特殊性，有必要建立相应的资料库，以正确鉴定献血者血型及满足临床类似血型患者的用血需求。在福建人群中类孟买血型有相对较高频率(1∶8 500)[7]，因此我们建立了类孟买血型献血者资料库，至今已为临床类似血型患者提供60余人次输血支持。

目前遗传学上用双结构基因理论来解释类孟买血型的形成机制：FUT1(H)基因编码产物为α(1,2)岩藻糖转移酶，共有365个氨基酸，作用底物是2型糖链，特异性催化2型H形成；FUT2(Se)基因编码产物为α(1,2)岩藻糖转移酶，共有332个氨基酸，作用底物是1型糖链，特异性催化1型H形成，因各自作用的底物不同，最终使得FUT1基因决定H抗原在红细胞上的表达，FUT2基因决定H抗原在分泌腺和消化液中的表达[1]。典型的类孟买血型即红细胞H抗原缺乏分泌型，其H基因无活性而Se基因有活性。此外，类孟买型也可能是红细胞H部分缺乏非分泌型，其FUT1基因并非完全失活，而是功能减弱，导致了2型H的弱表达。目前发现的无活性FUT1基因达60多种，包括错义突变、无义突变、移码突变等。国内报道了其中的17种[6]，常见的突变类型为h1、h2、h3和h4，其他h基因零星散在。本研究在10例样品中检出4种无效h等位基因(h1、h2、h3和h9)；检出2种FUT2等位基因：Se357与Se357,716。结合前期研究[7-8]，在福建地区47例类孟买血型个体中共观察到6种无效h等位基因(h1、h2、h3、h4、h9和h328A)，其中h1基因占69.2%(65/94)，h2基因占20.2%(19/94)，进一步证实h1和h2为福建地区类孟买型个体的主要流行基因，与其他文献报道相近[5-6,9]；其中45例类孟买血型样品的FUT2基因均含有357C>T同义突变，同时15例还存在716G>A错义突变，13例为杂合子，2例为纯合子；17条Se357,716等位基因均与h2同步出现，且2例Se357,716纯合的个体，其FUT1基因也为h2纯合，提示Se357,716与突变等位基因h2密切相关。在Luo等[6]和Cai等[10]的研究中，共有11例含有h2基因个体其FUT2基因为Se357,716。但在郭忠慧等[11]的研究中，共有4例个体含有h2基因，仅2例存在相应Se357,716等位基因，另2例含有h2基因的个体其FUT2为Se357纯合，与Yip等[4]报道的5例含有h2基因个体的h2-Se357单元型相同。由于相关文献中未提供确切的地域或个体祖籍数据，同时目前相关研究样品数量有限，突变等位基因h2与Se357,716是否存在连锁遗传关系或是具有地域特征，还有待进一步研究证实。