13株肺炎链球菌标准菌株分子生物学特征分析*

李康，黄洋，石继春，王春娥，徐潇，陈琼，赵丹，叶强

(中国食品药品检定研究院生物制品检定所细菌多糖和结合疫苗室，中国医学细菌保藏管理中心，北京 102629)

肺炎链球菌是引起儿童肺炎球菌性疾病的主要病原菌，其感染可引起急性中耳炎、鼻窦炎、肺炎、脑膜炎、菌血症等[1]。根据荚膜多糖抗原的不同，肺炎链球菌可以分为90多个血清型[2]。肺炎链球菌标准菌株是研制肺炎链球菌疫苗及诊断试剂重要的原材料，因此肺炎链球菌的质量控制至关重要。传统的肺炎链球菌质量控制方法如培养特性、染色镜检、生化反应、胆汁溶菌试验、奥普托欣试验、荚膜肿胀试验等在肺炎链球菌的分离、鉴定和质量控制中发挥了重要的作用[3-4]，但部分菌株缺乏相关的分子生物学数据，无法准确分辨菌株之间的差异，质量标准有待进一步提升。因此，本研究主要针对中国医学细菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections, CMCC)保藏的13株肺炎链球菌标准菌株，在传统质量检定的基础上，进行16S rRNA基因分析和多位点序列分型(multilocus sequence type, MLST)，补充这些菌株分子生物学质控数据，为进一步完善肺炎链球菌的质量标准提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1菌种 13株肺炎链球菌标准菌株CMCC(B)31001、31439、31447、31456、31477、31495、31510、31547、31310、31228、31687、31761和31267来源于CMCC。

1.2主要仪器与试剂 NU-5810E型CO2培养箱(NUAIRE公司)，BX-51型生物显微镜(OLYMPUS公司)，microTyper MS飞行时间质谱系统(江苏天瑞公司)，PTC-0200型基因扩增仪、powerpac型电泳仪电源、Gel Doc XR+型凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)。哥伦比亚血琼脂(BD公司)，肺炎链球菌分型血清或因子血清(丹麦血清学研究所)，细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen公司)，Premix Taq和DL2000(TaKaRa公司)，PCR引物由上海英潍捷基公司合成。

1.3培养特性及显微形态观察 13株肺炎链球菌标准菌株划线于含5%羊血的哥伦比亚血琼脂培养基上，37 ℃、5% CO2倒置培养过夜，观察菌落形态，并进行革兰染色观察菌株的显微形态。

1.4血清凝集试验 在洁净的载玻片上，取少量过夜培养的新鲜菌苔与适量生理盐水混合制备菌悬液。分别与等量的肺炎链球菌分型血清或因子血清混匀，放置片刻，出现明显凝集现象的判定为阳性(+)，呈均匀浑浊现象的为阴性(-)，以生理盐水作为对照。

1.5质谱鉴定 菌种经过夜培养后，参照参考文献[5]中所述直涂法进行质谱鉴定。谱图分析得分大于2.0，鉴定结果达到种水平置信。

1.6肺炎链球菌分子质控方法

1.6.1DNA的提取 肺炎链球菌经过夜培养后，刮取菌体。参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，于-20 ℃保存备用。

1.6.216S rRNA基因分析 参照文献[6]，以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增13株肺炎链球菌标准菌株16S rRNA基因序列。PCR产物委托上海生工生物公司进行Sanger法测序。测序使用ABI 3730XL测序仪及其配套试剂。将测序结果与EZ BioCloud(https://www.ezbiocloud.net/identify)数据库进行比对分析，并应用MEGA软件将测序结果序列与肺炎链球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列(LN831051)进行系统进化分析。

1.6.3MLST 参照文献[6]，以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增7种管家基因aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt和ddl。PCR产物委托上海生工生物公司进行Sanger法测序。测序使用ABI 3730XL测序仪及其配套试剂。将测序得到的基因序列与肺炎链球菌MLST数据[7]进行比对，获得等位基因编号(或者申请新的编号)，所有等位基因编号组成菌株最终的基因序列型ST(aroE-gdh-gki-recP-spi-xpt-ddl)或申请新的ST编号。

2 结果

2.1培养特性及显微形态观察 13株肺炎链球菌标准菌株经培养过夜后，菌落形态均呈圆形、湿润、灰白色或灰色，并且有草绿色的α溶血现象。革兰染色符合肺炎链球菌的特征，革兰染色阳性，呈双球或短链状排列。图1所示为菌株CMCC(B)31228菌落形态和革兰染色结果。

图1 CMCC(B)31228菌落形态(左)和革兰染色(右)结果

2.2血清凝集试验 结果显示，除CMCC(B)31228和CMCC(B)31267外，其余11株肺炎链球菌均与相应的肺炎链球菌分型血清或因子血清产生凝集反应。CMCC(B)31228显示15b-、15c+、15e-、15h-的凝集结果，型别判定为15A型。CMCC(B)31267显示35a+、35b-、35c+、29b+、42a-的凝集结果，型别判定为35B型。见表1。

2.3质谱鉴定 13株菌株质谱鉴定结果均为肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，且分值在2.08～2.32之间，鉴定准确度高，见表1。图2所示为CMCC(B)31001质谱鉴定结果。

图2 CMCC(B)31001质谱鉴定结果

表1 13株肺炎链球菌标准菌株的血清凝集及质谱鉴定结果

2.416S rRNA基因分析 13株肺炎链球菌标准菌株DNA经16S rRNA基因特异性引物扩增后均扩增出预期大小约1 500 bp的16S rRNA基因片段，与EZ BioCloud数据库比对后，与肺炎链球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列(LN831051)的相似性均在99.00%以上，系统进化分析结果显示，CMCC(B)31439和CMCC(B)31456与肺炎链球菌模式株NCTC 7465同属于一个分支，其他11株肺炎链球菌属于另一分支，见图3。

图3 13株肺炎链球菌菌株与模式菌株16S rRNA基因的系统进化分析

2.5MLST分型 13株肺炎链球菌标准菌株共分为13个ST型，分别为ST2296、ST180、ST2759、ST3844、ST12973、ST12977、ST3545、ST16632、ST875、ST10189、ST870、ST342和ST7234。菌株CMCC(B)31547的ST16632为新发现的ST型。

3 讨论

CMCC保藏有大量不同时期收集的不同型别的肺炎链球菌国家标准菌种，这些菌种常被用于教学、科研、质量控制、疫苗研发以及诊断试剂参考品研制等。因此，确保肺炎链球菌国家标准菌种质量稳定、可靠、可溯源具有重要意义。传统的质量控制方法已被广泛应用于肺炎链球菌的分离、鉴定和质量控制[3]，但传统方法主要以区分菌株的表型差异为主，不能很好地区分相同表型的不同菌株之间的差别。近年来，16S rRNA基因分析、PCR血清分型、MLST分型、PFGE分型和基因组测序等分子生物学技术在多种病原微生物的质量控制和溯源分析中都发挥了重要作用，是传统菌株质量控制方法的有力补充[6,8-11]。本研究采用培养特性、染色镜检、血清学试验和质谱鉴定方法对CMCC保藏的13株肺炎链球菌标准菌株进行初步质量复核，进一步测定了菌株的16S rRNA基因序列，结果显示16S rRNA基因分析结果与质谱鉴定结果一致。与质谱鉴定方法一样，虽然测定16S rRNA基因序列能很方便地鉴定菌株是否为肺炎链球菌，并进行系统进化分析，但是无法区分不同型别的肺炎链球菌，在肺炎链球菌菌株的溯源中存在一定的局限。

MLST分型方法因具有很高的分辨能力，易实现标准化和不同实验室间的对比分析，已成为研究分子进化和分子流行病学的重要手段[12]。本研究对13株肺炎链球菌标准菌株的MLST分型结果显示，共分为13个ST型，说明肺炎链球菌的MLST序列呈现良好的多样性和辨识度，可以作为一种分子标签用于不同型别肺炎链球菌菌株的鉴定和溯源分析。有研究报道，11A、15A、35B和23A等多药耐药的肺炎链球菌血清型有增加的趋势[13]。国内疫苗研发企业也在考虑将24F和35B型用于多价肺炎球菌结合疫苗的研发[14]。本研究前瞻性地对CMCC保藏的15A型和35B型肺炎链球菌进行了检定和分析，获得了15A型菌株CMCC(B)31228和35B型菌株CMCC(B)31267的16S rRNA基因序列和MLST分型数据。

综上，本研究获得了13株不同型别的肺炎链球菌标准菌株的16S rRNA基因序列信息和MLST分型数据，完善了肺炎链球菌标准菌株的档案信息，为肺炎链球菌菌株溯源和质量标准的进一步完善提供了数据支撑。