输血对早产儿喂养不耐受及肠道菌群的影响*

曾超，吴迪，丘文，周宏伟，沈薇

(1. 南方医科大学南方医院新生儿科，广州 510515； 2. 南方医科大学珠江医院检验医学部，广州 510282)

喂养不耐受(feeding intolerance，FI)，指新生儿肠内喂养后出现呕吐、腹胀、胃潴留、血便等临床表现，在早产儿中具有较高的发病率(25%～53%)[1-3]。该疾病与特定新生儿胃肠道不成熟或肠道功能障碍密切相关[4]，常是坏死性小肠结肠炎或败血症等严重疾病的早期临床表现[4-5]。对于胎龄<34周的非晚期早产儿，输血是生命早期较为常见的医疗干预措施[5]。有研究报道，输血可能是FI的独立危险因素[6]，尤其是进行红细胞输注可引发缺氧肠组织再灌注损伤[7]，进而增加坏死性小肠结肠炎风险[8-10]。近年来，肠道菌群紊乱在坏死性小肠结肠炎中的角色日益受到关注[11]，而输血可否通过改变肠道菌群影响FI，进而对坏死性小肠结肠炎发挥作用未见报道。本研究回顾性分析输血对FI事件的潜在影响，初步探索输血治疗的早产儿出现肠道FI表型与肠道菌群内环境间潜在关联。

1 对象和方法

1.1研究对象 以2021年3月至2021年6月南方医科大学南方医院新生儿科重症监护室(NICU)住院收治的早产儿为研究对象。纳入标准：(1)胎龄<34周或出生体重<2 000 g；(2)出生后即转入新生儿科病房，存活>7 d；(3)获家属知情同意。排除标准：(1)合并有多发畸形、遗传代谢性疾病，伴有血流动力学改变的动脉导管未闭或其他紫绀型心脏病；(2)存在需要外科干预的疾病；(3)存在先天性免疫缺陷性疾病，或母亲合并免疫性疾病；(4)生后1周内进行过输血治疗或输注过血液制品；(5)出院或因其他疾病转院时尚未达足量喂养等出院标准者。根据生后第1周后是否输注红细胞，分为输血组和对照组。本研究通过南方医科大学南方医院伦理委员会审查并获批准(NFEC-2021-054)。

1.2资料收集 采用回顾性分析。观察至生后4周或出院时间。依据患儿病情，遵循科室临床诊疗规范，统一确定红细胞输血量、输血标准及输血持续时间。早产儿均为配方奶喂养，喂养间隔时间3 h。输血前1～2 h及输血期间奶量减半，输血结束后喂养量恢复干预前体积。调查输血组在输血起始干预后2周内以及对照组在对应周龄段是否发生FI及其临床特征(包括腹胀、呕吐、暂停喂养等症状次数)。并采集两组达全胃肠内喂养时间、住院时长等资料。FI诊断标准依据中国医师协会新生儿科医师分会循证专业委员会指定的《早产儿喂养不耐受临床诊疗指南(2020)》，具体为：胃残余量超过前一次喂养量的50%，伴有呕吐和/或腹胀；或喂养计划失败，包括减少、延迟或中断肠内喂养[12]。

收集患儿性别、出生体重、胎龄，出生时是否有窒息缺氧，生后第1周是否合并急性呼吸窘迫综合征和感染性疾病等一般资料。其中感染性疾病特指细菌感染，包括：羊膜腔内感染、早发型新生儿败血症(包含临床败血症)、化脓性脑膜炎、肺炎等，与新生儿窒息及新生儿呼吸窘迫综合征均参照人民卫生出版社第5版《实用新生儿学》诊断标准[13]。

1.3标本采集 采集输血组输血后的第1周、第2周2次粪便样本，如期间多次输血则以第1次输血为准。该时间节点对应于对照组生后第3周至第4周出生周龄，采集对照样本。所有样本采集时均使用一次性粪便采样管，收集尿布上非表层粪便0.5 g，置入无菌冻存管，迅速保存于-80 ℃待测。

1.4主要仪器与试剂 Nano Drop 2000超微量分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，VII7000实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，Illumina iSeq 100(美国Illumina公司)；QIAamp Mini Kit(德国Qiagen公司)， PCR检测试剂盒(美国Invitrogen公司)，蛋白酶K(美国Sigma公司)，Phix溶液(美国Illumina公司)，分析纯异丙醇、无水乙醇和氯仿(广东光华化学厂)。

1.5方法

1.5.1DNA提取 -80 ℃保存的粪便样本，置于4 ℃融解后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒QIAamp Mini Kit，参照试剂盒说明书，提取粪便菌群总DNA。用Nano Drop 2000超微量分光光度计检测DNA浓度及纯度，DNA产物保存于-20 ℃备用。

1.5.2PCR扩增 以16S rRNA V4区作为扩增靶标，选用V4可变区的上游引物 514F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′、下游引物805R：5′-CCGGACTACNVGGTWTCTAAT-3′，对粪便总DNA进行PCR扩增。上述引物插入序列不同的条码序列以区分样本。扩增体系20 μL，包括：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，514F 0.4 μL，805R 0.4 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR循环条件为：94 ℃ 2 min；90 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,30个循环；72 ℃ 5 min；5 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.5.316S rRNA测序 根据样本定量PCR扩增曲线中的最高值G，计算各个样本所需混样量，同一批次PCR样本均匀混样后纯化，以Phix溶液将混样稀释成50 pmol/L浓度的DNA溶液，取20 μL用于上机测序。开启Illumina iSeq 100平台，点击GenerateFASTQ2.0.0.9模式进行建库，选择Nextera XT工具，设计双末端碱基测序长度为161，命名测序项目，然后点击Sequence按平台默认程序测序。测序结束后查看测序数据质量，确认Phix数据占有量接近30%，去掉重复克隆簇后的测序量/总测序量(ClusterPF%)大于75%。

1.5.4生物信息学分析 使用DADA2(版本1.6.0)对每个粪便样本的16S rRNA测序读数进行去噪以生成扩增子序列变体(amplicon sequence variants，ASV)。通过PyNAST算法比对代表性序列并通过FastTree构建系统发育树。基于Greengene(版本13.8)数据库，使用RDP分类器的默认参数对ASV进行物种注释。来自试剂对照的ASV被排除在下游分析之外。所有后续的生物统计分析均使用QIIME(版本1.9.1)软件或R语言(版本4.0.5)进行。根据ASV的注释结果，分别在各个分类水平统计各样本的物种相对丰度，绘制菌群堆叠图、柱状图展示菌群构成；同时分析ASV的分类比对结果，比较在输血组和对照组中观察到的ASV，以Y表示输血组，N表示对照组，对两组的菌群数据分别进行α多样性分析及β多样性相异矩阵分析。通过主成分分析(principal component analysis，PCA)图对两组数据的相似性进行可视化，用于显示基于β多样性相异矩阵和排列多元方差分析(PERMANOVA)的样本之间的差异，进行999次置换来估计分组β多样性的统计显著性。

2 结果

2.1入组患儿基础资料 本研究共纳入早产儿33例，其中生后第1周后进行过红细胞输注早产儿共14例，为输血组；同期无输血史早产儿19例，为对照组。两组早产儿的性别、胎龄、出生体重以及基础疾病等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，组间具有可比性。见表1。

表1 两组患儿一般临床资料比较

2.2FI事件比较 输血组中12例发生FI事件(85.7%)，相关FI症状数为(7.7±5.4)次/人；对照组出现7例FI(36.8%)，其相关症状数为(6.7±5.9)次/人。两组早产儿FI事件发生率差异有统计学意义(P=0.005)，但两组FI患儿间症状频次差异无统计学意义(P=0.712)。见表2。两组达到全胃肠内喂养所需的时间、住院时长及住院花费间差异均无统计学意义。本研究两组患儿观察至4周龄，均未发生坏死性小肠结肠炎。

表2 两组发生喂养不耐受(FI)事件的比较

2.3肠道菌群比较 研究共获得来源于33例早产儿的粪便样本55份。测序并经质控后，共获得610 515条序列，有效序列为10 758(7 416，13 060)条/样本。经DADA2去噪后得到1 476个ASV，归一化到3 180条序列后，保留55个样本和1 379个ASV进行下游分析。根据细菌门水平(Phylum)分类展示，该阶段早产儿输血组与对照组总体构成相似(图1)，其肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为主，并存在一定比例的放线菌门(Actinobacteria)及拟杆菌门(Bacteroidetes)细菌。在非输血组，还观察到少数个体肠道以浮霉菌门(Verrucomicrobia)为优势丰度菌。

注：Y，输血组；N，对照组。

依据ASV水平的菌群多样性分析，四类α多样性指数，无论是Chao1(反应物种总数)、observed otu(物种丰富度指数)、PD_whole_tree(系统发育多样性指数)、Shannon(香农指数，同时反映物种丰富度及均匀度)，两组间差异均无统计学意义，见图2A-D。在β多样性分析中，依据Bray-Curtis距离(基于ASV的计数统计比较两个群落微生物的组成差异)的PCA，输血干预组与对照组呈区分趋势，但P值为0.089，见图2E。

注：Y，输血组；N，对照组；A,Chao1;B，observed_otus;C，PD_whole_tree;D，Shannon;E,PCA。

在属水平，发现两组间的特定菌丰度差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。输血组葡萄球菌属(Staphylococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)显著高于对照组；而肠球菌属(Enterococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)及阿克曼氏菌(Akkermansia)则显著下降。

3 讨论

本研究结果发现，经历输血事件早产儿治疗结束后2周内，FI发生率显著高于对照组。尽管样本量较小，但本研究中对照组FI发生率与文献报道一致[1-3]，提示本研究结果相对可靠。既往研究主要关注输血干预与新生儿坏死性小肠结肠炎发生率间关联，但二者间是否存在显著关联，系统评价结果并不一致[6-7,10,14]。从FI发展为新生儿坏死性小肠结肠炎，存在复杂的外界环境(包括喂养、机械通气、药物等)及个体病理进程(缺氧、感染等)多因素影响[15]。本研究结果提示，以FI为首要终点事件，将更有利于揭示输血事件与不良肠道事件间的潜在关联，从而为未来的临床干预提供新线索。

尽管两组间FI发生率存在显著差异，但两组间发生FI事件患儿的临床表现并无差别，且两组最终达到全胃肠内喂养时间及住院时长差异均无统计学意义。该结果提示输血事件并未导致更严重的FI，且对于病情的恢复及整体治疗影响较小。其中一项潜在的原因是，本研究单位输血治疗时常规采取奶量减半喂养保护策略，可能减小了输血对肠道的干扰。另外，本研究中部分早产儿由于住院时间不足4周而只留取到1份样本，可能使结果产生一定的偏倚；同时，发生FI患儿均未发生坏死性小肠结肠炎，存在一定的幸存者偏倚。

注：Y，输血组；N，对照组；Abundance,丰度。

本研究发现，输血组葡萄球菌属、寡养单胞菌属相对丰度增加，双歧杆菌属及肠球菌属相对丰度减少。双歧杆菌是健康婴儿肠道主要优势菌，对肠道和宿主的发育具有重要作用[11]；健康早产儿肠球菌的相对丰度显著高于FI早产儿[16]；葡萄球菌、寡养单胞菌与坏死性小肠结肠炎、败血症发病高度相关[17]。绝大多数早产儿均接受多种抗菌药物治疗，对肠道菌群整体产生显著影响。因此，输血组与对照组间α及β多样性差异均不显著。但两组间差异菌与既往报道的FI及坏死性小肠结肠炎存在关联，提示肠道菌群在上述疾病中可能具有潜在的因果作用，其具体机制值得深入探讨。

本研究不足之处在于样本量偏小，未能对是否红细胞输注、输血量、输血次数等进行进一步的亚组分析，无法为肠损伤机制研究提供线索。从菌群角度，进一步扩大样本量，将有助于探明输血是否可以改变肠道菌群β多样性，并为探明特定肠道菌作为FI乃至坏死性小肠结肠炎风险预测新型标志物提供可能。