葡萄糖调节蛋白78影响乳腺癌细胞株MCF-7的黏附及迁移能力的研究

王作胜 王芳 张秀秀

(日照市中心医院肿瘤科，山东 日照 276800)

肿瘤的转移主要是通过直接浸润、淋巴及血液循环中的循环肿瘤细胞三种途径实现。肿瘤细胞同质性粘附降低，从原发灶脱离，之后与细胞外基质( Extracell-ular Matrix，ECM)发生异质性粘附，并导致其受到破坏或降解，同时肿瘤细胞与ECM大分子相互作用，形成肿瘤进入细胞并且形成逃避免疫系统的通道。基质金属蛋白酶(matrix Metallo-proteinases，MMPs)是ECM降解代谢的主要酶类，其中，基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)与肿瘤的侵袭转移最密切[1-2]。葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)是参与内质网新生肽聚集、调节内质网钙稳态、抗内质网相关性细胞凋亡，也是未折叠蛋白反应(UPR)的核心调节因子，在肿瘤的增殖、凋亡以及侵袭转移中发挥重要的作用[3-5]。本研究主要探讨乳腺癌细胞株MCF-7的黏附及迁移能力与GRP78的关系及调控机理。

1 材料与方法

1.1材料 乳腺癌细胞MCF-7，江苏凯基生物技术股份有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，Hyclone公司；Lipofectamine 2000、G418、500U/mL青/链霉素，美国Invitrogen公司；明胶，碧云天(上海)生物技术有限公司；pEGFP-N1-GRP78及pEGFP-N1质粒，上海吉凯基因化学技术有限公司；Matrigel胶，前尘(上海)生物制剂有限公司；GRP78、MMP-2、MMP-2抗体及二抗，均来自美国CST公司。

1.2方法

1.2.1MCT-7细胞的培养及转染 用RPMI1640+10% FBS+100 U/ mL青霉素—链霉素培养基置于37℃，5% CO2培养箱中培养，48 h后吸弃培养基，加入PBS洗3次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶置于培养箱中30 s，消化，加入10%FBS终止消化。加入培养基重悬细胞，调节细胞浓度至6×105个接种于直径40 mm的培养皿，每皿加2 mL培养基。24 h后，细胞融合到80%～90%时，按照Lipofectamine2000说明书将pEGFP-N1空载体、pEGFP-N1-GRP78质粒转染到MCF-7细胞中。72 h后，吸弃原有培养基并更换为含有400 μg/mLG418培养基，以此筛选可以在G418培养基中生存的细胞。

1.2.2细胞黏附试验 将浓度为12.6 g/L的 Matrigel母液用PBS稀释成50 mg/L，100 μL/孔加入六孔板中，对照孔中加入等体积的1%BSA于37℃培养箱中孵育2 h，弃上清，4℃保存备用。分别收集生长状态良好且处于对数生长期的MCF-7/UT、MCF-7/N1、MCF-7/GRP78细胞，调整细胞浓度至1×109个/L后接种于6孔板中，设3个平行复孔/组，置于培养箱中培养2 h后，吸弃培养基，PBS洗2次，消化后加入PBS充分重悬细胞，并进行细胞计数，3个复孔细胞计数的平均值作为本组的黏附细胞总数，计算黏附率。黏附率(%)=粘附细胞总数/总细胞数×100%。

1.2.3细胞划痕试验 将消化下来的细胞用培养基重悬，并接种于直径40 mm培养皿中，加入RPMI1640+10%FBS培养基培养基2 mL/皿，置于37℃，5%CO2培养想中过夜培养约10 h，第2天置于倒置显微镜下观察细胞生长情况，若融合成单层细胞，取10 μL得移液枪头平整得在培养皿上划一直线，并马上更换为RPMI1640+1% FBS培养基，分别于0、48 h后吸弃培养基，并在显微镜下观察细胞的迁移情况。用Imagetool软件计算迁徙率。迁徙率(%)=[(初始划痕宽度值-现划痕宽度值)]/初始划痕宽度值×100%。

1.2.4Western blot检测 RIPA+1 nmol/L PMSF裂解液裂解收集的三种细胞，提取细胞总蛋白，用BCA法测定总蛋白浓度，用TBS稀释样品至相同浓度，制作电泳样品，并进行凝胶电泳，电泳完成后半干转膜仪转膜，1% BSA封闭，根据不同的分子量裁膜，分别加 GRP78、MMP2、 MMP9一抗，4℃过夜孵育，TBST洗涤3次，5 min/次，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤3次，5 min/次，洗涤结束后，置于Bio-Rad凝胶成像仪中进行显色操作。Gel-Pro analyzer检测条带灰度值。

2 结 果

2.1转染后各细胞中GRP78的表达情况 与其他两组细胞(MCF-7/UT与MCF-7/N1)对比，GRP78在MCF-7/GRP78细胞中的表达水平更高(P<0.05)，MCF-7/UT与 MCF-7/N1细胞中GRP78的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 不同细胞中GRP78的表达(*P<0.05,**P>0.05)

2.2GRP78对细胞黏附能力的影响 MCF-7/UT、MCF-7/N1、MCF-7/GRP78三种细胞的迁移率(%)分别为：(32.1±1.75)、(31.99±1.01)、(45.80±1.5)。培养2 h后MCF-7/GRP78细胞的黏附率比另两种细胞明显增强，而MCF-7/UT、MCF-7/N1细胞黏附率并无明显变化。见图2。

图2 不同细胞黏附率的大小(*P<0.05,**P>0.05)

2.3GRP78对细胞迁移能力的影响 MCF-7/UT、MCF-7/N1、MCF-7/GRP78在培养48 h后的迁移率分别为：(0.55±0.14)、(0.62±0.23)、(0.94±0.30)，由此得出MCF-7/GRP78细胞迁移能力更强。而MCF-7、MCF-7/N1细胞48 h后的迁移能力无明显变化。见图3。

图3 不同细胞迁移率的大小(×100，*P<0.05,**P>0.05)

2.4Western blot检测 MCF-7/GRP78细胞中MMP2、MMP9表达水平明显升高(P<0.05)；MCF-7/UT与MCF-7/N1细胞中MMP2、MMP9表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 不同细胞MMP-2、MMP-9的表达水平(*P<0.05,**P>0.05)

3 讨 论

乳腺癌作为女性健康“第二大杀手”，外科手术、放疗及化疗依然是治疗的常规手段，这两种方法对患者来说身心都饱受折磨。另外晚期患者往往会发生肿瘤转移，常规的治疗方法并不能从根本上阻止癌细胞的浸润及转移。肿瘤的侵袭转移是一个多种机制参与的复杂过程，其影响因素至今尚未明确。MMPs作为一类金属离子依赖的蛋白水解酶家族，其几乎能降解细胞外基质中所有的蛋白成分，从而阻断肿瘤侵袭的屏障，在调节细胞增殖、黏附、迁移、血管生成、细胞凋亡和宿主防御等方面起重要作用，在肿瘤侵袭转移中的作用逐渐受到重视，被认为是该过程中的主要水解酶类之一[6]。目前发现人类的MMPs是由28个成员组成，参与许多不同的生理病理过程[7]。其中MMP-2和MMP-9起到了显著的作用，研究[8-9]表明当细胞恶变时，MMP-2和MMP-9表达量会升高，这两种细胞因子以酶原形式分泌，须水解后功能才能激活，激活后对阻挡癌细胞浸润的组织屏障进行降解破坏，加速肿瘤细胞的侵袭转移，而阻断MMPs的功能后乳腺癌的侵袭则受到抑制，因此MMP-2、MMP-9与乳腺癌的侵袭转移关系密切[10-11]。

为了进一步探讨GRP78在乳腺癌细胞对正常细胞进行侵袭转移时的作用机制，我们通过构建GRP78真核表达载体并将构建好的质粒转染至MCF-7细胞中，并通过细胞黏附实验及划痕实验评估未经处理的MCF-7细胞、转染空质粒的细胞MCF-7-pEGFP-N1及转染GRP78真核表达载体的细胞MCF-7-pEGFP-GRP78三种细胞的黏附及迁移能力；WesternBlot计算三种细胞中MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平。结果发现GRP78的表达量提高后，MCF-7细胞黏附、迁移能力及MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平均明显升高。证实GRP78能够通过提高MMP-2及MMP-9的表达进而加速乳腺癌细胞的黏附及迁移。