系统性红斑狼疮患儿血清抗内皮细胞抗体检测的临床意义

高岭，王莉，殷丝雨，刘丽莎

(1.南京医科大学附属儿童医院 检验科，南京 210008；2.皖南医学院 医学检验系，芜湖 241002)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种常见的系统性自身免疫性疾病，主要病理改变为血管炎性病变，可累及全身多个器官，其病因与发病机制尚不明确。SLE患者体内可产生多种自身抗体，大量免疫复合物沉积是导致内皮损伤和血管炎发生的主要原因[1]。抗内皮细胞抗体(anti-endothelial cell antibody，AECA)是针对血管内皮细胞膜抗原而产生的一组抗体，可在多种血管炎性疾病患者的外周血中检出，其在SLE病理损伤的作用日益引起人们重视[2]。本研究将对AECA在SLE患儿外周血中的表达情况及其临床意义作一初步探讨，以期寻求有利于SLE患儿疾病诊断及活动性判断的新标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象选取35例2018年6月—2019年10月在南京市儿童医院风湿免疫科住院部明确诊断为SLE的患儿为研究对象，其中活动期患儿20例、缓解期15例。患儿均符合《系统性红斑狼疮诊治指南(草案)》中对SLE的诊断标准[3]，同时排除其他自身免疫性疾病及合并心、肺、肾、脑、造血系统等严重疾病者，样本采集前均未接受药物治疗。SLE疾病活动性的判断以SLE疾病活动性评分(systemic lupus erythematosus disease activity index， SLEDAI)为标准，≥9分为疾病活动，<9分为病情缓解。同时选取15例择期手术儿童作为对照组，各组患儿性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。以上样本的收集均获得患儿家属知情同意和医学伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 分别采集SLE患儿和对照组儿童静脉血3 mL，采用常规方法分离血清，-70 ℃冻存待用。

1.2.2 血清AECA检测 采用间接免疫荧光试剂盒(欧蒙医学诊断有限公司)，以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)为底物，样本1∶10稀释后检测血清中IgG型AECA。荧光显微镜下在细胞质中可见绿色颗粒荧光判定为阳性，颗粒型荧光在靠近细胞核的位置上颗粒显得更丰富。同时分别设置阴、阳性对照用于判断实验的有效性。

1.2.3 血清dsDNA检测 采用间接免疫荧光试剂盒(欧蒙医学诊断有限公司)，样本1∶10稀释后检测血清中dsDNA。同时分别设置阴、阳性对照用于判断实验的有效性。

1.2.4 血清免疫球蛋白检测 采用BNⅡ特种蛋白检测分析仪(Siemens 公司)速率散射比浊法定量检测患儿血清中IgA、IgM、IgG和C4的含量。

1.2.5 炎性因子检测 用AccessⅡ化学发光仪定量检测患儿血清中可溶性白细胞介素2受体(soluble interleukin 2 receptor，sIL-2R)、IL-6和TNF-α的含量。

1.2.6 尿微量蛋白检测 采用尿微量蛋白分析仪检测尿微量白蛋白(microalbuminuria，MA)、尿IgG(urine IgG，IGU)和尿α1微球蛋白(α1 microglobulin，A1M)的含量。

2 结果

2.1 各组患儿血清IgG-AECA阳性率的比较35例SLE患儿中IgG-AECA阳性18例，阳性率为51%，其中20例活动期SLE组患儿中14例外周血IgG-AECA阳性，阳性率为70%，15例缓解期SLE组患儿中4例IgG-AECA阳性，阳性率为33%，15例对照组儿童外周血中IgG-AECA均为阴性。SLE组患儿以及活动期SLE组患儿IgG-AECA阳性率与对照组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，而缓解期SLE组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 SLE组患儿外周血中dsDNA的检测SLE患儿外周血中dsDNA阳性率为40%，活动期时可高达55%，抗dsDNA和IgG-AECA联合检测时阳性率为69%，活动期时可高达90%。SLE患儿特别是活动期患儿使用抗dsDNA和IgG-AECA联合检测阳性率高于仅使用抗dsDNA检测(P<0.05)，表明IgG-AECA在SLE疾病诊断，特别是活动性判断中具有一定的意义。详见表1。

表1 SLE患儿外周血中dsDNA阳性率分析

2.3 IgG-AECA阳性组患儿和IgG-AECA阴性组患儿体液免疫相关指标的比较IgG-AECA阳性组患儿外周血中IgA、IgM和IgG水平均高于IgG-AECA阴性组(P<0.05)，C4水平低于IgG-AECA阴性组(P<0.05，表2)。

表2 2组患儿体液免疫相关指标差异分析

2.4 IgG-AECA阳性组患儿和IgG-AECA阴性组患儿炎性因子水平的比较分别观察2组患儿外周血中常见炎性因子sIL-2R、IL-6和TNF-α的表达情况，可见IgG-AECA阳性组患儿外周血中炎性因子的表达显著高于IgG-AECA阴性组(P<0.05，表3)。

表3 2组患儿炎性因子水平的比较

2.5 IgG-AECA阳性组患儿和IgG-AECA阴性组患儿纤维蛋白降解产物(fibrin degradation products，FDP)和D-二聚体水平的比较IgG-AECA阳性组患儿外周血中反映凝血系统中纤维蛋白溶解功能的指标FDP和D-二聚体水平明显高于IgG-AECA阴性组(P<0.05，表4)。

表4 两组患儿外周血浆中FDP和D-二聚体水平的比较

2.6 IgG-AECA阳性组患儿和IgG-AECA阴性组患儿继发狼疮性肾炎 (lupus nephritis，LN)情况分析18例IgG-AECA阳性组患儿中继发LN 10例，发病率为56%，17例IgG-AECA阴性组患儿中继发LN 3例，发病率为18%，IgG-AECA阳性组SLE患儿LN患病率高于IgG-AECA阴性组(P<0.05)。

2.7 IgG-AECA诊断LN的ROC曲线分析IgG-AECA诊断LN的ROC曲线，结果显示，IgG-AECA诊断LN的AUC为0.703(95%CI：0.522～0.883)，灵敏度和特异度分别为0.769和0.636(图1)。

图1 IgG-AECA诊断LN的ROC曲线

2.8 LN组患儿AECA阳性与否与其尿微量蛋白表达差异分析分别观察继发LN的患儿中IgG-AECA阳性组和IgG-AECA阴性组患儿MA、IGU和A1M的表达情况，可见IgG-AECA阳性组患儿上述3项指标均高于IgG-AECA阴性组患儿(P<0.05)，表明IgG-AECA可加重患儿肾脏的损伤。详见表5。

表5 LN组患儿AECA阳性与否与其尿微量蛋白表达差异分析

3 讨论

SLE是一种原因不明的自身免疫性疾病，病变可累及多种系统、组织和器官。儿童SLE是指青春期前后的SLE，它的发病率在0.4/10万～0.6/10万，占所有SLE患者的15%～20%，且亚洲儿童的发病率高于全球水平。与成人相比，儿童SLE起病更急、病情更重、病程更为迁延，且常出现重要脏器损害，当病变累及肾脏系统时称为LN。SLE在遗传因素、环境因素、激素水平等多种因素共同作用下引发，但具体的发病机制尚不清楚[4]。作为自身免疫性疾病，SLE发病过程中伴随着大量自身抗体的产生，抗原抗体复合物可沉积于各组织器官，引起组织器官病理性损伤。患者体内存在的多种自身抗体不仅仅作为疾病诊断的血清标志物，也可作为致病因子参与疾病的发生、发展[5-6]。SLE早期症状不典型，易发生误诊， 如能对SLE患者进行早期诊断和治疗对改善患者预后具有积极作用。目前，临床评估SLE常用的特异性体外诊断标志物为抗Sm抗体，是 SLE 的标志性抗体，特异度可达到99%，但灵敏度仅为25%，且出现后持续阳性，与疾病活动性无关。抗dsDNA抗体作为判断疾病活动性的标志物，灵敏度较差，易发生漏检。因此，寻求新的可以预测 SLE发生、进展和恶化的生物标志物有利于临床更好地认识疾病的发生、发展过程。AECA是一种针对内皮细胞(endothelial cell，EC)表面靶抗原的异质性抗体，可表达于多种以血管炎为主要特征的疾病患者外周血中。AECA造成EC损伤的具体机制可能为：AECA激活EC，上调炎性因子、细胞因子和黏附分子等表达，诱导淋巴细胞、单核细胞黏附于EC表面，继而引起更多淋巴细胞、单核细胞与EC黏附，进一步激活EC导致血管炎的发生[7-8]。AECA可在多种内皮损伤性疾病患者外周血中检出，如混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease， MCTD)[9]、肺动脉高压[10]、风湿性心脏病[11]等。国内外学者对AECA与SLE的关系进行了一些研究，发现在活动期SLE患者外周血中亦可检测出AECA，其靶抗原主要是盐酸肝素、DNA或DNA-组蛋白，核糖体P蛋白、核糖体蛋白L6、延长因子Ⅰa、线谱酸环化酶相关蛋白、纤溶酶原活抑制剂、纤维连接素等[12]，表明AECA作为免疫活性物质参与SLE疾病发生、发展过程，即AECA与EC结合后通过一系列信号通路促进炎性介质的产生[13-15]。有研究表明，AECA在SLE以及LN的病理损伤中发挥了一定的作用，与疾病的活动性相关[16-17]。韦薇等[18]的研究结果表明，SLE患者AECA阳性率为36%，但AECA阳性率在是否合并LN患者之间无显著性差异；刘娜娜等[19]的实验结果显示，AECA水平与LN疾病活动程度相关。本研究结果显示，在SLE患儿体内可检测出IgG型AECA，且活动SLE患儿阳性率明显高于缓解期SLE患儿和择期手术患儿。IgG-AECA阳性组患儿IgG、IgM、IgA水平明显高于IgG-AECA阴性组患儿，C4水平明显低于IgG-AECA阴性组患儿。此外，IgG-AECA阳性组患儿D-二聚体和FDP水平较IgG-AECA阴性组明显升高，炎性因子、尿微量蛋白含量均高于IgG-AECA阴性组患儿。以上结果表明，SLE患儿体内IgG-AECA与相应抗原结合后激活补体系统，通过介导机体免疫功能紊乱、炎性介质释放、凝血纤溶系统活化等参与疾病的发展过程。此外，IgG-AECA与肾脏EC结合后可引起肾脏功能损伤，尿微量蛋白含量升高，在LN发生、发展中起着一定的致病作用。尽管本研究病例数量较少且只采用了间接免疫荧光法进行检测，所得结论也会与其它研究存在一定的差异，但现有结果为AECA在SLE患儿致病机制中作用的研究提供了研究依据，为进一步开展深入研究奠定了基础。综上所述，IgG-AECA参与SLE的病理过程，对LN的诊断具有临床指导意义。