抗核糖体P蛋白、抗Smith、抗dsDNA、抗核小体及抗组蛋白抗体对系统性红斑狼疮的临床价值探讨

王艳萍，邹麟，郭婷，陈曦，史静，陈瀑

(重庆医科大学附属第一医院 检验科，重庆 400016)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE)是一种由抗自身抗体介导、累及全身结缔组织的疾病，其病因及发病机制复杂，好发于中年女性患者[1]。SLE的临床表现多样，常累及皮肤、关节、肾脏、中枢神经系统等重要组织和器官。多数患者在疾病初期临床症状较轻，仅出现1～2个器官受损，后逐渐转变为多器官病变；也有部分患者早期便出现多器官损伤甚至狼疮危象[2]。

SLE患者血清中存在多种自身抗体，这些抗体与SLE患者的疾病进展、活动度及临床表现密切相关，但与SLE发生发展直接相关的抗体并不多[3]。目前，抗Smith抗体(anti-Smith antibody，anti-Sm)、抗dsDNA抗体(anti-dsDNA)已被广泛运用于SLE的临床诊断中。anti-Sm是SLE的标志性抗体，其与SLE疾病活动度无明显相关性，治疗后仍持续阳性[4]；抗dsDNA抗体与狼疮肾炎(lupus nephritis， LN)的发生密切相关，并被证实与SLE的疾病活动度也有很大相关性[5-6]。另有一些研究表明，抗核糖体P蛋白抗体(anti-ribosomal P protein antibody，anti-P)、抗核小体抗体(anti-nucleosome antibody，ANuA)和抗组蛋白抗体(anti-histone antibody， AHA)也是SLE特异性抗体，其中anti-P与神经精神性狼疮有关[7]，ANuA与LN有一定相关性[8]，而AHA可能与药物性狼疮有关。因此，本研究旨在系统性比较anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA对SLE的诊断价值，并进一步探讨这5种自身抗体与SLE患者的临床表现及疾病活动度的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究资料收集并回顾性分析2016年1月—2018年12月于重庆医科大学附属第一医院收治的351例SLE患者，200例非SLE自身免疫性疾病患者(non-SLE)和100例健康对照者(healthy control， HC)的临床资料，其中SLE患者纳入标准符合修订版1997年美国风湿病学会SLE分类标准，在资料的收集整理过程中筛选首次于该院治疗患者的临床数据，剔除无效和重复数据。本研究经重庆医科大学附属第一医院医学伦理委员会审核批准，所有患者均了解研究内容并签署知情同意书。狼疮肾炎(lupus nephritis， LN)除满足SLE的诊断标准，还需符合以下3项诊断标准中至少1项：(1)蛋白尿持续阳性，24小时尿蛋白定量>0.5 g，或随机尿检查尿蛋白呈强阳性(+++)，或尿蛋白/肌酐比值>500 mg/g(50 mg/mmol)；(2)尿液中检出细胞管型，包括红细胞管型、血红蛋白管型、颗粒管型、管状管型和混合管型；(3)有活动性尿沉渣[除尿路感染外，尿白细胞>5 个/高倍视野(high power field， HPF)，尿红细胞>5 个/HPF]，或尿液中存在红细胞、白细胞管型。肾活检病理检查显示免疫复合物介导的肾小球肾炎则进一步确诊为LN[9]。non-SLE组包括130例类风湿关节炎、25例干燥综合征、5例自身免疫性肝炎、20例原发性胆汁性胆管炎、4例混合性结缔组织病和16例皮肌炎患者。HC无任何疾病史，包括结缔组织病。

1.2 观察指标

1.2.1 临床表现 在患者首次入院并未接受过任何治疗前统计其一般临床资料如性别、年龄、有无高血压、糖尿病等基础疾病史。同时，记录其是否有皮肤红斑、蝶形红斑、盘状红斑、皮疹或光敏感，是否出现脱发、关节炎、浆膜炎、口腔溃疡等临床表现以及是否有眩晕、记忆力减退甚至癫痫等神经精神性狼疮症状或典型的LN表现。

1.2.2 实验室检查指标 采用非抗凝管分别抽取患者外周静脉血4 mL，2 775×g离心15 min后，分离血清用于anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA以及补体C3、C4水平的检测，若不能及时检测则分离血清分装后于-20 ℃低温冷冻备用。

1.2.3 SLE疾病活动指数(SLE disease activity index，SLEDAI)评分 用SLEDAI-2000积分评估疾病活动度，评分细则及评判标准如下(表1)。

表1 SLEDAI-2000积分类目及活动度评判标准

1.3 患者血清自身免疫性抗体水平的检测如1.2.2所述检测患者外周静脉血样本血清自身免疫性抗体及补体水平。其中，采用间接免疫荧光法检测anti-dsDNA：(1)在包被有绿蝇短膜虫的生物载片中加入25 μL 1∶11稀释的血清，室温孵育30 min；(2)用PBS流动冲洗生物载片并浸泡载片5～10 min；(3)于每张生物载片中加入25 μL 羊抗人IgG-FITC抗体，室温孵育30 min；(4)重复步骤(2)；(5)于每张生物载片表面滴加1滴甘油后封片。anti-P、anti-Sm、ANuA和AHA的检测采用EUROIMMUN全自动免疫印迹分析仪，所有自身抗体的检测试剂均购自欧蒙医学诊断(中国)有限公司。血清补体C3、C4采用贝克曼库尔特IMMAGE 800全自动特定蛋白分析仪检测。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件分析数据，定性资料以n(%)表示，使用χ2检验或Fisher确切概率法分析；定量资料以中位数M(P25，P75)表示，采用两个独立样本的非参数检验Mann-WhitneyU检验；两变量间的相关性检测采用Spearman相关性分析。检验水准(α)为0.05。

2 结果

2.1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA对SLE的诊断价值

2.1.1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA在不同组别中的阳性率 5种自身免疫性抗体在SLE组、non-SLE组和HC组中的阳性率如下，其中SLE组的阳性率显著高于non-SLE和HC组(均P<0.01，表2)。

表2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA在不同组别中的阳性率

2.1.2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA对SLE的诊断价值比较 5种抗体对SLE的诊断特异度均大于95.0%，但灵敏度相对较低，5种抗体任一阳性检测的灵敏度可达70.1%(表3)。同时，经统计单一 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、 ANuA 和AHA阳性在这5种抗体总阳性SLE患者中所占的百分比分别为26.8%、31.5%、20.8%、8.6%和7.8%(数据不充分，暂不列表中)。

表3 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA对SLE的诊断价值

2.2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA与SLE临床特征的关系anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA阳性组和阴性组在SLE发病年龄上差异有统计学意义(均P<0.05)；anti-P阳性组皮肤红斑发生率较高，ANuA阳性组脱发发生率较高，anti-dsDNA、ANuA和AHA阳性组LN发生率更高，且与阴性组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)(表4)。

表4 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA与SLE临床特征的关系

2.3 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA与SLE疾病活动度的关系除anti-Sm外， anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA阳性组与阴性组比较有更高的SLEDAI，差异有统计学意义(均P<0.05，表5，图1)。其中anti-P和anti-dsDNA滴度在无活动，轻、中、重度活动组患者中的百分比差异都有统计学意义(均P<0.01，表5，图1)。补体C3、C4水平在5个抗体阳性组和阴性组之间差异都具有统计学意义(均P<0.01，表5)。Spearman相关性分析显示SLEDAI与C3浓度存在显著负相关性(r=-0.395，P=0.000)，与C4水平也存在显著负相关性(r=-0.314，P=0.000)(图2)。

表5 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA分组与SLEDAI及血清补体水平的关系

图1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA不同分类下SLEDAI的分布

图2 SLEDAI评分与补体C3、C4水平的相关性

3 讨论

本研究全面地回顾性分析比较了anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA对SLE的诊断价值。通过表2和表3的数据可知，这5种抗体对SLE的诊断都具有很高的特异度，但灵敏度欠佳，与其他研究结果一致[10]。值得注意的是，这5种抗体任意一种阳性时诊断SLE的灵敏度可提高至70.1%而特异度仍然保持在92.3%，准确度也可达80.3%。这说明anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA的联合检测与单个抗体检测相比可明显提高诊断的灵敏度和阴性预测值，减少漏诊，同时特异度和阳性预测值也不会有明显的降低。但是，这5种抗体整体的灵敏度较其他研究略低，可能是方法学的原因造成的，本研究中anti-P、anti-Sm、ANuA 和 AHA是采用Western blotting检测的，而anti-dsDNA是采用间接免疫荧光法检测的。其实，对于SLE的特异性抗体的检测，优先推荐ELISA、蛋白芯片或者化学发光法等重复性和稳定性更好的检测方法[11-12]。但是为了能够筛查多种系统性结缔组织病，目前中国的大型三甲医院实验室普遍都采用能够一次性检测多种自身抗体的Western blotting试剂。这种检测方法相较于其他几种方法的试剂灵敏度可能要差一些，并且由于多种抗体同时检测也不能完全避免交叉反应。但是Western blotting试剂能够一次性同时检测10多种自身抗体，缩短检测时间，对于系统性结缔组织病的筛查效率要明显高于其他方法。本研究进一步分别分析了这5种自身抗体单个阳性占整体阳性SLE患者的百分比，发现相比于ANuA和AHA，anti-P、anti-Sm和anti-dsDNA单个抗体阳性检出率更高，单独检测的意义较大。

研究第二部分进一步分析了anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA与SLE临床特征的关系，由于每种抗体阳性组中同时也包含有其他阳性抗体，并没有进行两两抗体间临床特征的比较，而是单纯就某种抗体阳性和阴性组SLE患者的临床表现进行了分析。结果显示，anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA阳性组患者发病年龄较阴性组更小(均P<0.05)，与 Olesińska等[13]的研究结果一致；而其中anti-P阳性组的发病年龄最小，中位年龄仅39岁。Reichlin等[14]的研究也显示，anti-P在青少年期发病的SLE患者中阳性率为42%，远远高于成年期发病的SLE患者(7.7%)，进一步证实了本研究的观点。目前尚未有研究发现其具体机制，仅发现年幼期发病的SLE患者anti-P阳性率更高并且临床症状更严重，其具体原因还需深入探索。

本研究中，anti-P阳性和阴性组皮肤红斑的发生率分别为31.3%和19.7%，差异显著(P<0.05)，表明anti-P阳性与SLE患者皮肤损伤有关。国内外也有研究发现，anti-P阳性的SLE患者面部红斑和光敏感发生率更高[15]。与没有皮肤病变的患者相比，有皮肤损伤的SLE患者自身抗体的阳性率更高，这可能与两种特异性抗原(酸性核糖体P0蛋白和半乳凝素3)有关[16]，然而由这2种抗原介导的皮肤损伤的分子机制仍需进一步探索。ANuA阳性组脱发发生率较阴性组显著升高(P<0.05)。脱发是SLE患者常见的非特异性皮肤表现之一，其发生率为17.3%～54.0%，主要是非瘢痕性脱发，脱发是疾病加重的非特异性表现，还能预测SLE的复发[17]。目前关于自身抗体与SLE脱发这方面的研究并不多，查阅相关文献后没有发现ANuA与SLE脱发相关性的报道。但国内的一项大样本研究发现缺乏抗可提取核抗原抗体(包括ANuA) 的SLE患者，其脱发的患病率比其他患者低[18]。

LN是SLE患者最常见的并发症，50%～70%的SLE患者发生临床肾脏受累，肾功能衰竭也是重要死因。本研究结果显示，anti-dsDNA、ANuA和AHA阳性组SLE患者更容易出现LN，与其他研究结果一致[19]。anti-dsDNA是SLE高度特异性抗体，与dsDNA结合后形成免疫复合物沉积于肾脏，诱发免疫反应，引起肾脏损伤。核小体是染色体的基本结构单位，组蛋白是核小体的重要组成部分，ANuA不仅能与染色质表面暴露的组蛋白抗原表位结合，还能结合dsDNA及dsDNA与组蛋白相互作用产生的构象表位，形成免疫复合物沉积于肾脏；其又在核小体的介导下使ANuA结合至肾小球基底膜上，激活补体系统，引起LN[20]。在SLE小鼠模型中，ANuA还可诱导AHA和anti-dsDNA的产生。因此，anti-dsDNA、ANuA和AHA三者相辅相成，共同导致LN的发生。

目前，临床医生主要通过SLEDAI评估SLE患者的疾病活动性。同时，在SLE患者中，自身抗体与相应抗原结合后沉积在组织器官中，激活补体产生炎症反应从而降低血清补体水平，因此，补体C3、C4水平也常常用于反映SLE的活动性[21]。本研究中，除anti-Sm，anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA阳性组的SLEDAI都显著高于阴性组(有P<0.05)，说明这4种抗体都与SLE的疾病活动性有关。进一步按照SLEDAI评分将5种抗体阳性组和阴性组的SLE患者再细分为无活动、轻、中、重度活动4组，发现anti-P和anti-dsDNA在4组患者的分布上差异显著(均P<0.01)，ANuA在无活动和重度活动度患者中分布有显著性差异(均P<0.01)，而AHA只在无活动患者中分布有统计学差异(P<0.05)。在疾病活动度的分布上anti-P和anti-dsDNA有较好的一致性，中度和重度活动度患者在其阳性组中所占的百分比分别达72.4%和66.6%，说明anti-P可以和anti-dsDNA一样作为反映SLE疾病活动度的指标，并且阳性与SLE的高疾病活动度有关。C3、C4水平在5个抗体阳性组和阴性组之间都有显著差异(均P<0.01)，并且与SLEDAI评分存在显著负相关性(P<0.01，r<-0.300)。但是C3、C4浓度在SLEDAI没有显著差异的anti-Sm阳性组和阴性组之间也存在统计学差异，并且与SLEDAI的相关性系数分别只有-0.395和-0.314，为弱负相关性。这说明补体C3、C4可在一定程度上反映SLE的疾病活动度，但直接作为SLE疾病活动度的判断指标可能还不够理想。

综上所述，anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA 和 AHA 对SLE的诊断具有较高的特异度，但灵敏度较差，联合检测可大大提高SLE的诊断准确率。抗核抗体、抗磷脂抗体(包括抗心磷脂抗体、抗β2糖蛋白1抗体和狼疮抗凝物)以及补体C3、C4对于SLE的诊断也具有重要意义，需同时检测。相比于ANuA和AHA，anti-P、anti-Sm和anti-dsDNA单个抗体阳性率更高。anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA阳性的SLE患者发病年龄更小，anti-P阳性与SLE皮肤红斑发生率有关，ANuA阳性与SLE脱发可能存在一定关联，而anti-dsDNA、ANuA和AHA阳性时LN的发生率更高。anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA都与SLE的疾病活动度有关，anti-P可以和anti-dsDNA一样作为反映SLE疾病活动度的指标，并且与SLE的高活动性有更大关联。补体C3、C4可以在一定程度上反映SLE的疾病活动性，但直接作为SLE疾病活动度的判断指标可能还不够理想。