飞龙掌血根的化学成分研究

朱勤凤，聂莉，陈倩，雷丹丹，廖尚高，徐国波（贵州医科大学药学院，贵州 贵安新区 550025）

飞龙掌血Toddalia asiatica（L.）Lam.是芸香科飞龙掌血属植物，又名三百棒、大救驾、三文藤、牛麻簕，产自秦岭南坡以南各地，全株用作草药，多用其根[1]。《贵州省中药材民族药材质量标准》记载其具有袪风止痛、散瘀止血、消肿解毒等功效，主要用于治疗风湿痹痛、胃痛、跌扑损伤等症[2]。文献报道该植物的化合物结构类型包括香豆素类、生物碱类以及三萜类等[3]，具有抗炎镇痛、抗氧化、止血、抗心血管疾病等药理活性[4]。为促进飞龙掌血植物资源的综合开发与利用，本实验对采自贵州贵阳的飞龙掌血根开展深入的化学成分研究。

1 材料

1.1 仪器与试药

Shimadzu UV-2401A 紫外可见分光光度仪（Shimadzu 公司，日本）；Bruker Tensor-27 傅里叶变换红外光谱仪、Bruker AV-600 型超导核磁共振仪（Bruker 公司，德国）；LC3000 制备型高效液相色谱仪（北京创新通恒科技）；WB-2000 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；薄层色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20 柱色谱凝胶（Pharmacia 公司，瑞典）；沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，杭州百思生物技术有限公司）；白假丝酵母菌（ATCC 5314，广东省微生物保藏中心）；两性霉素B（＞750 μg·mg－1，批号：J0602A，大连美仑生物技术有限公司）；所用试剂均为分析纯或色谱纯。

1.2 药材

飞龙掌血药材于2020年6月采集于贵阳市南明区，经贵州医科大学中药民族药标本馆龙庆德副教授鉴定为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血Toddalia asiatica，留样标本（No.2020062301）保存于贵州医科大学药学院天然药物化学教研室。

2 方法

2.1 化合物提取与分离

飞龙掌血干燥根4.0 kg 粉碎后经95%乙醇（20 L×3）冷浸提取，提取液减压浓缩得流浸膏580 g。流浸膏上样于D101 大孔树脂层析柱，40%～95%乙醇水梯度洗脱，洗脱液经过TLC薄层色谱检测，合并相似部分，得到7 个组分，分别为Fr.A～Fr.G。

Fr.D（72.0 g）放置后析出淡黄色针状结晶，即得化合物2（17.3 g），其余部分用硅胶柱色谱分离，以石油醚-丙酮（9∶1，V/V）洗脱，得到16 个组分Fr.D1～Fr.D16。其中Fr.D12、Fr.D15 在乙酸乙酯-甲醇溶液中析出淡黄色结晶，用乙酸乙酯-甲醇（1∶1，V/V）反复洗涤，分别得到化合物10（30.9 mg）和化合物3（1.2 g）。剩余部分通过薄层色谱（TLC）分析后合并相似馏分，得到12 个组分（Fr.D1a～Fr.D12a）。Fr.D2a（0.110 g）经硅胶柱层析、Sephadex LH-20 分离纯化得到化合物8（3.2 mg）和化合物13（1.8 mg）。Fr.D3a（1.2 g）经Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶色谱分离得到化合物11（13.2 mg）。Fr.D4a 段经Prep-HPLC 液相色谱制备得到化合物5 [4.9 mg，甲醇-水＝54∶46（V/V），tR＝32.5 min，流速3 mL·min－1]以及化合物1 [4.0 mg，甲醇-水＝70∶30（V/V），tR＝19.0 min，流速3 mL·min－1]。

Fr.E（14.602 g）经硅胶柱层析石油醚-乙酸乙酯（5∶2，V/V）洗脱得到3 个组分Fr.E1～Fr.E3。Fr.E1（62.1 mg）经硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱纯化得到化合物6（6.2 mg）和化合物4（2.0 mg）。Fr.E3 经Sephadex LH-20 分离得到化合物7（3.1 mg）和化合物9（2.3 mg）。Fr.E2 经硅胶柱色谱用不同比例溶剂体系洗脱，得到5 个组分（Fr.E2-1～Fr.E2-5），Fr.E2-3（50.4 mg）经Prep-HPLC液相色谱制备[甲醇-水＝54∶46（V/V），tR＝32.0 min，流速 3 mL·min－1]分离得到化合物12（8.6 mg）（各化合物结构见图1）。

图1 化合物1～13 的化学结构Fig 1 Structure of compound 1～13

2.2 抗菌活性筛选

将受试菌于－80℃冰箱取出，用接种环挑取一环接种在沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）里，28℃培养24 h，麦氏比浊法后用无菌蒸馏水稀释至最终浓度为（5～10）×105CFU·mL－1。采用96 孔板二倍稀释法检测单体化合物的最低抑菌浓度（MIC）值[5-6]，各单体化合物用0.02%DMSO无菌水溶液分别配制成256 μg·mL－1的储备液，用无菌蒸馏水稀释进行二倍稀释，最终得到质量浓度分别为256、128、64、32、16、8、4 μg·mL－1的样品溶液。在96 孔板中分别加入100 μL 不同浓度的样品溶液和100 μL 受试菌液，设置两性霉素B 为阳性对照，0.02% DMSO 无菌水溶液为阴性对照和空白对照（无菌对照组），将接种好的菌株放在28℃培养箱中培养24 h 后记录MIC值。在空白组无细菌生产的情况下，实验孔内完全抑制细菌生长的最低样品浓度为该样品对受试细菌的MIC值，各样品每次实验重复3 次。

3 结果

3.1 化合物结构鉴定

化合物1：无色针状晶体（甲醇）。UVλMeOHmax331，258，204 nm；IRνKBrmax1729，1602，1428，1171，1055 cm－1。HR-ESIMS 给出其准分子离子峰m/z289.1085[M-H]－（计算值为289.1081），确定其分子式为C16H18O5，不饱和度为8。化合物1 的1H-NMR（CD3OD，600 MHz）谱数据（见表1）显示其有2 个甲氧基信号，δH4.07（3H，s，-OCH3），δH3.80（3H，s，-OCH3），2 个甲基信号δH1.70（3H，s，4'-CH3），δH1.79（3H，s，5'-CH3），1 对烯烃质子信号δH7.88（1H，d，J＝9.7 Hz） 和δH6.21（1H，d，J＝9.7 Hz）；1 个活泼羟基信号δH6.33（1H，s）；1 个烯烃信号δH5.21（1H，m）和1 个亚甲基信号δH3.39（2H，d，J＝6.9 Hz）。 同时13C-NMR（CD3OD，150 MHz）结合HSQC 谱表明该化合物含有16 个碳，分别为1 个酯基（δC160.5），3 个烯碳（δC：139.7，121.8，112.1），2 个甲氧基（δC：63.6，62.0），2 个甲基（δC：25.9，18.0），1 个亚甲基（δC：23.2），7 个季碳（δC：151.2，151.1，145.5，132.8，130.5，118.5，107.2）（见图2）。

图2 化合物1 的化学结构及主要1H-1H COSY、HMBC 相关信号Fig 2 Structure，1H-1H COSY，and key HMBC of compound 1

在HMBC 谱中，δH1.70（4'-CH3）和1.79（5'-CH3）分别与δC132.8（C-3'）和121.8（C-2'）有相关关系，结合1H-1H COSY 谱中观察到的δH5.21（H-2'）↔3.39（2H-1'）质子自旋偶合体系，表明分子结构存在异戊烯基片段；δH6.33（7-OH）与δC130.5（C-6）、151.2（C-7）、118.5（C-8）有相关，δH3.39（2H-1'）与δC151.2（C-7）、118.5（C-8）有相关，确定1 个羟基和异戊烯基分别位于C-7 和C-8 上。δH3.80（5-OCH3）和δC151.1（C-5）有相关，δH4.07（6-OCH3）和δC130.5（C-6）有相关，表明C-5 和C-6 位发生甲氧基取代。δH7.88（H-4）与δC160.5（C-2）和145.5（C-8a）相关，δH6.21（H-3）与δC160.5（C-2）和δC107.3（C-4a）相关以及δH6.21（H-3）↔7.88（H-4）偶合体系的存在，推测分子中存在不饱和内酯环。该化合物的NMR数据与文献报道的化合物6-methoxycoumurrayin[7]具有较高的相似度，不同之处在于该化合物少了7位的甲氧基信号。根据1H-NMR 和13C-NMR 谱信号结合1H-1H COSY，HSQC 和HMBC 谱信息，对化合物碳氢信号进行归属（见表1）。

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 数据(CD3OD，600 MHz/150 MHz)Tab 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1 (CD3OD，600 MHz/150 MHz)

根据以上数据推断，确定化合物1 的结构鉴定为6-methoxy-7-demethylcoumurrayin，是一个新的香豆素类化合物。

化合物2：淡黄色针状结晶（甲醇），HRESIMS 给出其准分子离子峰m/z247.0606 [M ＋H]＋（计算值为247.0601），分子式：C13H10O5。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.37（1H，d，J＝14.7 Hz，H-3），8.10（1H，d，J＝14.7 Hz，4-H），7.66（1H，d，J＝3.3 Hz，H-2'），7.08（1H，d，J＝3.3 Hz，H-3'），4.03（3H，s，5-OCH3），4.14（3H，s，6-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：161.0（C-2），114.2（C-3），140.0（C-4），109.5（C-4a），144.5（C-5），135.2（C-6），143.3（C-7），113.8（C-8），149.9（C-8a），145.5（C-2'），104.4（C-3'），62.5（6-OCH3），61.3（5-OCH3）。以上数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定化合物2 为茴芹内酯。

化合物3：淡黄色针状结晶（甲醇），HRESIMS 给出其准分子离子峰m/z247.0605 [M ＋H]＋（计算值为247.0604），分子式：C13H10O5。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.21（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），8.05（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），7.56（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2'），7.00（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3'），4.09（3H，s，5-OCH3），4.10（3H，s，8-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCI3）δC：160.5（C-2），112.8（C-3），139.4（C-4），107.6（C-4a），144.3（C-5），114.8（C-6），150.0（C-7），128.2（C-8），143.6（C-8a），145.1（C-2'），105.1（C-3'），60.8（5-OCH3），61.7（8-OCH3）。以上数据与文献[9]报道的1H-NMR、13C-NMR 数据基本一致，故鉴定化合物3 为异茴芹内酯。

化合物4：淡黄色粉末，HR-ESIMS 给出其准分子离子峰m/z301.1076 [M ＋H]＋（计算值为301.1071）， 分子式：C17H16O5。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.21（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），8.51（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），7.55（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2'），6.92（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3'），4.77（2H，d，J＝7.2 Hz，H-1''），5.53（1H，m，H-2''），1.67（3H，s，4''-CH3），1.63（3H，s，5''-CH3），4.11（3H，s，5-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：160.5（C-2），112.8（C-3），139.4（C-4），107.5（C-4a），144.3（C-5），114.5（C-6），150.8（C-7），126.9（C-8），144.3（C-8a），145.1（C-2'），105.0（C-3'），70.4（C-1''），119.8（C-2''），139.7（C-3''），25.8（C-4''），18.0（C-5''），60.7（5-OCH3）。以上数据与文献报道[10]基本一致，故鉴定化合物4 为珊瑚菜内酯。

化合物5：浅黄色粉末，HR-ESIMS 给出其准分子离子峰m/z493.1131 [M ＋H]＋（计算值为493.1129），分子式：C26H20O10。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：4.04（2H，m，H-3，H-3''），4.39（1H，m，H-4，H-4''），7.45（1H，d，J＝3.3 Hz，H-2'，H-2'''），6.73（1H，d，J＝3.3 Hz，H-3'，H-3'''），3.83（3H，s，5-OCH3，5''-OCH3），3.67（3H，s，6-OCH3，6''-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：164.7（C-2，C-2''），39.7（C-3，C-3''），38.2（C-4，C-4''），106.4（C-4a，C-4a''），139.4（C-5，C-5''），134.5（C-6，C-6''），148.1（C-7，C-7''），113.7（C-8，C-8''），147.5（C-8a，C-8a''），60.7（5-OCH3，6-OCH3，5''-OCH3，6''-OCH3），144.5（C-2'，C-2'''），103.9（C-3'，C-3'''）。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物5 为走马芹内酯。

化合物6：白色针状结晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.26（1H，d，J＝14.2 Hz，H-3），7.58（1H，d，J＝14.2 Hz，H-4），6.77（1H，s，H-5），5.75（1H，d，J＝15.1 Hz，H-3'），6.88（1H，d，J＝15.1 Hz，H-4'），3.89（3H，s，6-OCH3），1.53（6H，s，-CH3×2）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：161.4（C-2），113.4（C-3），144.4（C-4），111.6（C-4a），108.7（C-5），145.7（C-6），146.0（C-7），110.4（C-8），144.7（C-8a），78.2（C-2'），131.0（C-3'），115.4（C-4'），56.7（6-OCH3），28.1（-CH3×2）。以上数据与文献报道[12]基本一致，故鉴定化合物6 为布拉易林。

化合物7：白色粉末，HR-ESIMS 给出其准分子离子峰m/z275.1281 [M ＋H]＋（计算值为275.1278）， 分子式：C16H18O4。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.14（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），7.98（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），6.31（1H，s，H-6），3.43（2H，d，J＝7.3 Hz，H-1'），5.19（1H，t，J＝7.3 Hz，H-2'），1.65（3H，s，4'-CH3），1.82（3H，s，5'-CH3），3.91（3H，s，5-OCH3），3.92（3H，s，7-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：162.1（C-2），110.4（C-3），139.18（C-4），104.1（C-4a），155.5（C-5），90.6（C-6），161.2（C-7），111.1（C-8），153.8（C-8a），21.7（C-1'），122.1（C-2'），132.5（C-3'），18.3（C-4'），26.2（C-5'），56.3（5-OCH3），56.2（7-OCH3）。以上数据与文献报道[13]基本一致，故鉴定化合物7 为九里香内酯。

化合物8：淡黄色针状结晶（甲醇），HRESIMS 给出其准分子离子峰m/z271.0968 [M ＋H]＋（计算值为271.0965），分子式：C16H14O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.26（1H，d，J＝9.8 Hz，H-3），8.09（1H，d，J＝9.8 Hz，H-4），7.73（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2'），6.87（1H，d，J＝2.1 Hz，H-3'），3.75（2H，d，J＝6.7 Hz，H-1''），5.06（1H，t，J＝6.7 Hz，H-2''），1.69（3H，s，4''-CH3），1.86（3H，s，5''-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：162.9（C-2），113.9（C-3），143.8（C-4），115.1（C-4a），123.7（C-5），126.8（C-6），146.7（C-7），130.0（C-8），142.0（C-8a），147.7（C-2'），106.8（C-3'），28.5（C-1''），124.0（C-2''），133.3（C-3''），18.2（C-4''），25.8（C-5''）。以上数据与文献报道[14]基本一致，故化合物8 鉴定为别欧前胡素。

化合物9：橙色粉末，HR-ESIMS 给出其准分子离子峰m/z407.1134 [M ＋H]＋（计算值为407.1125），分子式：C23H18O7。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.05（1H，d，J＝9.7 Hz，H-3），7.97（1H，d，J＝9.7 Hz，H-4），6.34（1H，s，H-6），3.93（3H，s，5-OCH3），3.74（3H，s，7-OCH3），6.05（1H，s，H-3'），7.93（1H，s，H-5'），7.23（1H，s，H-7'），3.70（3H，s，2'-OCH3）2.43（3H，s，6'-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：161.5（C-2），111.1（C-3），139.0（C-4），104.0（C-4a），156.8（C-5）90.5（C-6），160.5（C-7）110.4（C-8），152.9（C-8a），56.2（5-OMe），56.3（6-OMe），185.4（C-1'），160.7（C-2'）108.7（C-3'）179.9（C-4'）133.6（C-4a'）127.5（C-5'）144.9（C-6'）138.8（C-7'），133.3（C-8'），127.2（C-8'a），56.5（2'-OCH3），22.0（6'-CH3）。以上数据与文献报道[15]基本一致，故化合物9 鉴定为飞龙掌血香豆醌。

化合物10：淡黄色棱晶（甲醇），HR-ESIMS给出其准分子离子峰m/z260.0921[M ＋H]＋（计算值为260.0917），分子式：C14H13NO4。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.91（1H，d，J＝13.8 Hz，H-5），7.15（1H，d，J＝13.8 Hz，H-6），7.50（1H，d，J＝4.2 Hz，H-2'），6.93（1H，d，J＝4.2 Hz，H-3'），4.32（3H，s，4-OCH3），3.94（3H，s，7-OCH3），4.03（3H，s，8-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：163.3（C-2），101.0（C-3），156.2（C-4），113.8（C-4a），117.2（C-5），110.9（C-6），140.3（C-7），151.1（C-8），140.8（C-8a），141.9（C-2'），103.6（C-3'），60.0（4-OCH3），55.7（7-OCH3），60.6（8-OCH3）。以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定该化合物为茵芋碱。

化合物11：无色粉末，HR-ESIMS 给出其准分子离子峰m/z216.0655 [M ＋H]＋（计算值为216.0655），分子式：C12H9NO3。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.47（1H，d，J＝5.4 Hz，H-2），6.91（1H，d，J＝5.4 Hz，H-3），7.58（1H，m，H-5），7.21（1H，t，J＝8.4 Hz，H-6），7.07（1H，m，H-7），4.28（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：162.5（C-2），103.8（C-3），157.5（C-4），118.7（C-4a），110.3（C-5），124.2（C-6），113.0（C-7），151.0（C-8），135.7（C-8a），143.3（C-2'），105.0（C-3'），59.0（4-OCH3）。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定该化合物为大叶桉亭。

化合物12：无色针状结晶（氯仿），HRESIMS 给出其准分子离子峰m/z200.0710 [M ＋H]＋（计算值为200.0706），分子式：C12H9NO2。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.43～8.26（4H，m，Ar-H），7.06（1H，d，J＝4.2 Hz，H-10），7.61（1H，d，J＝4.2 Hz，H-11），4.43（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：163.9（C-2），103.5（C-3），156.9（C-4），118.8（C-4a），122.5（C-5），123.8（C-6），129.7（C-7），127.9（C-8），145.7（C-8a），143.6（C-2'），104.9（C-3'），59.1（4-OCH3）。以上数据与文献报道数据一致[18]，故鉴定该化合物为白藓碱。

化合物13：无色油状物。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：5.43（1H，s，H-6），2.2（1H，m，H-11），0.94（3H，d，J＝6.0 Hz，12-CH3），0.92（3H，d，J＝6.0 Hz，13-CH3），1.91（3H，s，14-CH3），1.20（3H，s，15-CH3），3.37（5H，q，J＝8.0 Hz，-OCH2CH3），1.10（5H，t，J＝8.0 Hz，-OCH2CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：49.9（C-1），37.2（C-2），40.5（C-3），80.2（C-4），48.1（C-5），121.1（C-6），149.6（C-7），22.4（C-8），24.6（C-9），79.0（C-10），36.2（C-11），21.6（C-12），21.5（C-13），18.5（C-14），21.2（C-15），55.8（OCH2），16.3（OCH2CH3）。以上数据与文献[19-20]报道基本一致，故鉴定该化合物为4α-ethoxy-10αhydroxyguai-6-ene。

3.2 抗菌活性筛选

考察了单体化合物对白假丝酵母菌 ATCC 5314 的抑制作用。结果显示化合物11 对白假丝酵母菌 ATCC 5314 有一定抑制作用，MIC值为32 μg·mL－1（阳性对照两性霉素BMIC值＜1 μg·mL－1）。剩余化合物在浓度为128 μg·mL－1时对白假丝酵母菌未显示明显抑制作用。

4 讨论

本文对飞龙掌血根的95%乙醇提取液进行化学成分研究，从中分离鉴定化合物13 个，包括9 个香豆素类化合物（1～9）、3 个喹啉生物碱类化合物（10～12）以及1 个愈创木烷型倍半萜类化合物（13）。其中化合物1 为新化合物，化合物13 为首次从芸香科中分离得到。前期对飞龙掌血的化学成分研究主要集中在香豆素和生物碱类成分，笔者从中分离到了新的香豆素类化合物及倍半萜类成分，丰富了飞龙掌血的化学信息。文献报道飞龙掌血根的乙醇提取物有明显的抑菌效果[21-22]；白假丝酵母菌的抑制活性测试结果表明，仅有化合物11 具有一定的白假丝酵母菌抑制活性，提示可能是其他结构类型的化合物发挥抗菌作用，需要进一步研究阐明。