埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶的性质解析

郑文慧，刘佳伟，刘子铭，周哲敏，刘中美

(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

半胱亚磺酸脱羧酶(cysteine sulfinate decarboxylase，EC 4.1.1.36 6.3.2.5 AeCSAD)作为脱羧酶类中的一种，与谷氨酸脱羧酶、真核来源天冬氨酸脱羧酶同为磷酸吡哆醛(pyridoxal 5-phosphatemonohydrate，PLP)依赖型的蛋白酶。最早从动物肝脏中分离得到，具有催化半胱亚磺酸生成牛磺酸的生物活性[1]，对于哺乳动物早期性器官发育[2]和生命活动的正常进行具有重要作用。半胱亚磺酸脱羧酶除了具有催化半胱亚磺酸生成牛磺酸的活性外，还可以催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸[3-5]。

β-丙氨酸虽然是一种非蛋白氨基酸，但在各个领域都有广泛应用，是一种具有高应用价值的β-型氨基酸。在医药领域，β-丙氨酸是重要的医药前体，可用于合成维生素B5[6]、肌肽[7]、巴柳氮[8]、帕米磷酸钠等；在食品领域，β-丙氨酸既可提高人工甜味剂的口感，达到改善食品风味的效果[9]，又因为高效的抗氧化作用，可作为天然的食品保鲜剂延长食品保质期；在畜牧业，可作为饲料添加剂应用于动物养殖，可有效提高仔鸡的生产性能和肉质口感[10]；在环境领域，由β-丙氨酸合成的聚β-丙氨酸有净化絮凝的作用[11]，可用于污水处理；在化工领域，可用作铅中毒解毒剂和电镀缓蚀剂[12]。

生物法合成α-丙氨酸主要可以分为微生物发酵法和酶转化法，都涉及到的一个关键酶——L-天冬氨酸-α-脱羧酶。目前的研究主要集中在原核来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶[13]，但原核来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶需要经过自剪切才能具有活性[14]，并且存在酶活性低和自失活的问题[15]。BORODINA等[16]将赤拟谷盗来源的半胱亚磺酸脱羧酶与大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行比较，发现真核来源的半胱亚磺酸脱羧酶具有更高的催化活性，高宇[17]、王超等[18]对真核来源的半胱亚磺酸脱羧酶也进行了异源表达，证明真核来源的半胱亚磺酸脱羧酶较原核来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶具有更高的催化活性。

鉴于真核来源的半胱亚磺酸脱羧酶催化L-天冬氨酸的活性比原核来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶活性要高，我们将目光投向真核来源的半胱亚磺酸脱羧酶。本研究在大肠杆菌中成功表达埃及伊蚊来源的AeCSAD，并通过添加标签的方式有效提高了可溶性表达。对野生酶和带标签酶(sumo-AeCSAD)的酶学性质进行了表征，建立了从富马酸到β-丙氨酸的全细胞催化工艺，为生物法合成β-丙氨酸提供了理论支持和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

以pET-28a质粒作为表达载体，构建质粒宿主菌为Escherichia.coliJM109，表达宿主菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，感受态细胞购于安徽通用生物技术有限公司。该基因(NC_035108.1)在密码子使用图谱分析(http://www.gcua.schoedl.de)网站上进行密码子优化，由安徽通用生物技术有限公司合成。

1.1.2 试剂与设备

种子培养基为LB培养基，诱导培养基为2YT培养基。酵母提取物、蛋白胨，Oxford公司；Primer STAR MAX DNA 聚合酶、Gibson重组试剂盒，上海生工生物工程有限公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒，宝日医生物技术有限公司；L-天冬氨酸、β-丙氨酸、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)、卡那霉素及其他试剂，国产分析纯；衍生试剂苯异硫氰酸酯(phenyl isothiocyanate，PITC)，Sigma公司；sumo蛋白酶，安徽通用生物技术有限公司。

1.1.3 引物设计与合成

以半胱亚磺酸脱羧酶基因序列和pET-28a质粒基因序列为模板设计引物构建重组质粒。将目的基因成功插入质粒后，继续设计引物将sumo标签(NC_015446.3)和strep标签插入目的蛋白N端。引物序列如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 The primer sequences used in this study

1.2 实验方法

1.2.1 基因工程菌E.coliBL21/pET28a(+)-AeCSAD构建

以合成的半胱亚磺酸脱羧酶基因序列为模板，利用上述引物通过正向PCR获得目的基因片段，以pET-28a质粒基因序列为模板，通过反向PCR获得质粒骨架片段，扩增后的PCR片段通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，将验证正确的PCR片段胶回收并进行柱纯化。利用目的基因片段和质粒骨架片段具有的互补序列进行同源重组，以实现目的基因与载体的连接，获得重组质粒pET28a-AeCSAD，将构建好的重组质粒转化进E.coliJM109，涂于卡那抗性平板筛选阳性克隆子送去测序，将测序正确的菌株提取质粒转化入E.coliBL21用于后续表达，并保存于保菌管中。

获得重组质粒后，设计在目的蛋白N端添加sumo标签以提高目的蛋白在上清液中的可溶性表达，在sumo标签和目的基因之间添加strep标签，通过亲和层析纯化蛋白。构建方法同上所述，通过同源重组的方法进行片段连接。将成功添加sumo标签和strep标签的重组质粒转化入E.coliBL21用于后续表达，并将菌株保存于甘油管中。

1.2.2 AeCSAD诱导表达和纯化

将甘油管中的E.coliBL21/pET28a(+)-sumo-AeCSAD划线于卡那抗性的LB平板上，37 ℃培养12 h；在平板上挑单个菌落接种于质量浓度为50 μg/mL的卡那抗性的LB试管培养基中，37 ℃、200 r/min振荡过夜培养，以2%接种量转接入100 mL的2YT培养基中，37 ℃孵育2～3 h左右，待细胞生长至OD600值为0.6～0.8，温度降为20 ℃，添加终浓度0.2 mmol/L的IPTG诱导目的蛋白表达，诱导培养12～20 h。之后可以通过SDS-PAGE(5%浓缩胶，12%分离胶)确定重组蛋白的表达是否正确。

诱导结束后12 000 r/min离心5 min收集菌液，将收集后的细胞用结合缓冲液A(20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，280 mmol/L NaCl，6 mmol/L KCl，pH 7.4)悬浮，置于冰上超声破碎，在300 W的功率下破4 s，停6 s，持续30 min，待细胞悬浮液澄清，12 000 r/min离心40 min使细胞碎片沉淀，取上清液用0.22 μm滤膜过滤。

使用AKTA纯化仪(GE Healthcare UK Ltd.)进行蛋白纯化，按照操作手册进行实验操作。先用5倍柱体积的结合缓冲液A平衡柱子，待各参数稳定后，将10 mL细胞裂解上清液应用于strep柱，继续用结合缓冲液A平衡柱子，洗去杂蛋白。用10倍柱体积的洗脱缓冲液B(20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，280 mmol/L NaCl，6 mmol/L KCl，2.5 mmol/L脱硫生物素，pH 6.5)将目的蛋白及其变体从柱上线性洗脱下来，获得sumo-AeCSAD纯酶。继续用结合缓冲液A平衡柱子直至各项参数稳定再上下一个样品。

将收集到的纯酶进行一定浓度的稀释，以牛乳血清为标样，通过Bradford法测定蛋白浓度。根据测得纯酶的浓度，按照sumo蛋白酶的使用说明，1 mg融合蛋白添加10 μL sumo蛋白酶用于切除sumo标签，添加终浓度为150 mmol/L NaCl，混匀上述体系后4 ℃反应16 h。按照上述纯化方法，去除sumo标签和sumo蛋白酶，获得AeCSAD纯酶。重新通过Bradford法测定蛋白浓度。

1.2.3L-天冬氨酸和β-丙氨酸的检测方法

底物L-天冬氨酸和产物β-丙氨酸通过和PITC衍生获得衍生产物，然后采用HPLC方法进行检测。

具体的衍生方法为：将反应液上清液进行一定比例的稀释，取500 μL置于2 mL的EP管里，加入250 μL 0.1 mol/L 三乙胺乙腈溶液和250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液，充分混匀后置于暗处，避光衍生45～60 min，衍生结束后加入750 μL正己烷终止反应，涡旋振荡10 s，静止2 min直至溶液分层，用一次性注射器吸取下层反应液700 μL，用0.22 μm有机滤膜过滤，最后打入液相小瓶中，盖上盖子，防止乙腈挥发，放入液相样品盘中进行检测。

在液相的检测过程中，色谱柱采用La Chrome C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)，流动相A为80%的乙腈水溶液，流动相B为V(0.1 mol/L乙酸钠)∶V(乙腈)=97∶3。采用梯度洗脱的方法：0～20 min，B溶液由95%下降至65%；20～30 min，B溶液由65%上升至95%；30～43 min，B溶液梯度保持不变；检测波长254 nm，检测时间45 min，柱温40 ℃。

1.2.4 酶学性质的检测方法

酶活反应体系：500 μL反应体系，将适量的AeCSAD纯酶和sumo-AeCSAD纯酶液与终浓度为1 mmol/L的PLP混匀，用磷酸缓冲溶液(50 mmol/L，pH 6.0)补全体系，40 ℃下孵育10 min，添加终浓度为100 mmol/L的L-天冬氨酸钠盐激活反应，在40 ℃反应30 min后置于100 ℃灭活10 min，检测酶活力。

酶活力定义：在40 ℃，pH 6.0的条件下，1 min转化L-天冬氨酸钠盐生成1 μmol β-丙氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位。比酶活力定义：1 mg蛋白所含的酶活力单位数。

最适反应温度测定：同上述酶活反应体系，分别在30、35、40、45、50 ℃条件下测定AeCSAD和sumo-AeCSAD的酶活力。最高酶活力定义为100%，AeCSAD、sumo-AeCSAD最适温度以相对酶活力作图呈现。

最适反应pH测定：酶活反应体系中的其他条件不变，分别用pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的磷酸缓冲溶液补全体系，pH 6.0～8.0用磷酸盐缓冲溶液，pH 5.0～6.0用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。最高酶活力定义为100%，AeCSAD、sumo-AeCSAD最适温度以相对酶活力作图呈现。

温度稳定性测定：取适量AeCSAD纯酶和sumo-AeCSAD纯酶液于1.5 mL离心管中，分别在0、30、40、50、60 ℃金属浴中处理30 min后置于冰上冷却10 min。反应体系同上。检测结果以不同温度下相对酶活力作图呈现。

pH稳定性测定：取适量AeCSAD纯酶和sumo-AeCSAD纯酶液置于1.5 mL离心管中，再与等量体积pH 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸缓冲溶液混合，于4 ℃环境下处理12 h。反应体系同上,检测结果以不同pH下相对酶活力对处理时间作图呈现。

1.2.5 以富马酸为底物全细胞催化生产β-丙氨酸

为了进一步提高重组菌的蛋白表达量，首先对诱导条件进行了优化。诱导温度设定为20、25、30 ℃，IPTG浓度设定为0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L，之后通过SDS-PAGE确定重组蛋白的表达情况。

配制100 mmol/L富马酸氨水溶液，用盐酸调节成pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。将收集得到的细胞用100 mmol/L富马酸氨水溶液稀释至OD600=10，37 ℃下振荡反应6 h，通过薄板层析确定全细胞催化的最适pH。在最适pH条件下，用1 mol/L富马酸氨水溶液重悬诱导结束后的工程菌至OD600=100，10 mL反应体系，添加终浓度为1 mmol/L的PLP，37 ℃振荡反应，每间隔2 h取样1次，通过液相检测底物的消耗量和产物的生成量。

2 结果与分析

2.1 AeCSAD诱导表达和纯化

将埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶(XP_001658435.2)与谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行序列对比，结果显示相似度很低(图1)。谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶(WP_003857183.1)含有136个氨基酸，枯草芽孢杆菌来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶(NP_390122)含有127个氨基酸，两者同源性为48.91%。而埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶含有562个氨基酸，与原核来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶不具有同源性。

图1 BsADC、CgADC、AeCSAD序列比对Fig.1 Alignment of BsADC, CgADC, and AeCSAD

将构建成功的重组菌株进行诱导培养，破碎细胞后得到的上清液和沉淀经SDS-PAGE验证(图2)，电泳图谱显示在66.4 kDa附近有2条特异性条带。AeCSAD的理论分子质量是63 kDa，sumo-AeCSAD的理论分子质量是75 kDa，与电泳结果相吻合。sumo-AeCSAD上清液中的可溶性表达较AeCSAD明显增多，证明添加sumo标签有效的促进了AeCSAD在上清液中的可溶性表达。sumo-AeCSAD的破碎上清液经strep柱纯化后，获得sumo-AeCSAD纯酶，如图2泳道7所示，经SUMO蛋白酶切割后可将sumo标签完整的切割下来，切割后大小与AeCSAD大小一致，如图2泳道8所示。

M-标准蛋白Marker；1-AeCSAD未诱导全细胞；2-AeCSAD诱导后破碎上清液；3-AeCSAD诱导后破碎沉淀；4-sumo-AeCSAD未诱导全细胞；5-sumo-AeCSAD诱导后破碎上清液；6-sumo-AeCSAD诱导后破碎沉淀；7-纯化后sumo-AeCSAD；8-切割标签后AeCSAD图2 重组菌pET28a-AeCSAD和pET28a-sumo-AeCSAD表达产物的SDS-PAGE分析Fig.2 The SDS-PAGE analysis of expression products in pET28a-AeCSAD and pET28a-sumo-AeCSAD注：异源表达的sumo-AeCSAD和AeCSAD均用红色框标记

2.2 AeCSAD及sumo-AeCSAD的最适温度及温度稳定性

半胱亚磺酸脱羧酶作为一种生物催化剂应用到β-丙氨酸的生产中，温度对酶活力的影响会直接限制酶在工业中的实际应用。用AeCSAD及sumo-AeCSAD纯酶测定其最适温度及温度稳定性。测定结果如图3所示，随着反应温度的升高，2种酶的酶活力都呈现先升高后下降的趋势，AeCSAD和sumo-AeCSAD最适反应温度都是40 ℃(图3-a)。AeCSAD及sumo-AeCSAD在不同温度下孵育30 min后检测残余酶活力，活性随着温度的升高而降低，当温度高于40 ℃时，AeCSAD酶活力损失严重，在50 ℃时AeCSAD酶活力仅剩20%；sumo-AeCSAD的热稳定性明显优于AeCSAD，40 ℃时酶活力依旧能维持在较高状态，50 ℃时酶活力仍保留39.77%(图3-b)，赤拟谷盗来源半胱亚磺酸脱羧酶在50 ℃处理30 min，酶活力仅剩余19.61%[18]。

a-最适温度；b-温度稳定性图3 温度对AeCSAD、sumo-AeCSAD的酶活力及稳定性影响Fig.3 The influence of temperature on the activity and stability of AeCSAD and sumo-AeCSAD

2.3 AeCSAD及sumo-AeCSAD的最适pH及pH稳定性

AeCSAD和sumo-AeCSAD的最适pH及pH稳定性实验结果如图4所示。酶活力随着pH的升高呈现先上升后下降的趋势，两者的最适pH值均为6.0(图4-a)。sumo-AeCSAD在pH 5.5～7.5酶活力保持在80%以上；AeCSAD在碱性条件下稳定性相对较好，酸性条件下酶活力迅速下降(图4-b)。

a-最适pH；b-pH稳定性图4 pH对AeCSAD、sumo-AeCSAD的酶活力及稳定性影响Fig.4 The effect of pH on the activity and stability of AeCSAD and sumo-AeCSAD

在最适条件下测得AeCSAD比酶活力为(5.00±0.074) U/mg，sumo-AeCSAD比酶活力为(5.40±0.129) U/mg。赤拟谷盗来源半胱亚磺酸脱羧酶比谷氨酸棒杆菌来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶的酶活力高出2倍[17]。

2.4 全细胞催化

利用基因工程菌进行全细胞催化合成β-丙氨酸，首先对诱导表达条件进行优化，以期提高重组酶的表达量。诱导温度和诱导剂对sumo-AeCSAD表达的影响如图5、图6所示。诱导温度为20 ℃时，重组蛋白在上清液中的可溶性表达最多(图5-a)；改变诱导剂浓度对目的蛋白表达量影响不大，当诱导剂浓度为0.2 mmol/L时，目的蛋白表达量相对较多(图5-b)。确定最佳表达条件为诱导温度20 ℃，诱导剂浓度0.2 mmol/L。

因为天冬氨酸裂解酶活性远高于半胱亚磺酸脱羧酶[19]，故利用大肠杆菌自身的天冬氨酸裂解酶与半胱亚磺酸脱羧酶相偶联，催化富马酸合成β-丙氨酸。大肠杆菌天冬氨酸裂解酶的最适pH值为8.0，半胱亚磺酸脱羧酶的最适pH值为6.0，首先对全细胞催化的最适pH进行测定。分别在pH 5.5～8.5的条件下催化富马酸合成β-丙氨酸，薄板层析检测结果显示pH值为7.5时，β-丙氨酸产量最高(图6)，符合2个酶最适pH的折中原则[20]。

a-诱导温度优化;b-诱导剂浓度优化图5 表达条件优化Fig.5 Optimization of expression conditions注：红框表示目的蛋白表达量相对最多

图6 富马酸到β-丙氨酸全细胞催化最适pHFig.6 The optimal pH for whole-cell catalytic process from fumaric acid to β-alanine

在pH 7.5的条件下，以1 mol/L富马酸作为底物，全细胞催化合成β-丙氨酸。随着反应的进行，富马酸被转化为中间天冬氨酸和最终产物β-丙氨酸。β-丙氨酸标样和样品的HPLC检测峰图如图7-b、图7-c所示，催化反应进行24 h后，底物富马酸无剩余，中间产物L-天冬氨酸无积累，最终生成β-丙氨酸930.31 mmol/L(图7-a)，摩尔转化率达到93.03%，而赤拟谷盗来源半胱亚磺酸脱羧酶1次添加底物最终摩尔转化率仅为79.42%[18]。图7-c中22 min所出的峰为氨水。

a-全细胞催化历程图;b-β-丙氨酸标样HPLC检测峰图;c-样品HPLC检测峰图图7 富马酸到β-丙氨酸的全细胞催化工艺Fig.7 Whole-cell catalytic process from fumaric acid to β-alanine

3 结论

本研究通过添加sumo标签，实现了埃及伊蚊来源半胱亚磺酸脱羧酶在大肠杆菌中的异源表达。酶学性质表征结果显示AeCSAD和sumo-AeCSAD在40 ℃、pH 6.0时催化活性最高。添加标签后酶的稳定性明显提高，50 ℃处理30 min，sumo-AeCSAD剩余酶活力为39.77%，在pH 5.0～8.0酶活力都维持在80%以上。利用大肠杆菌自身的天冬氨酸裂解酶与半胱亚磺酸脱羧酶相偶联，催化富马酸合成β-丙氨酸，pH 7.5条件下，24 h后底物富马酸全部消耗，中间产物天冬氨酸没有积累，最终产物的转化率达到93.03%。