宫颈癌组织中自噬相关蛋白Beclin1的表达及临床意义

易 韵 郑子雯 杨小荣 娄 俊 杨心凤

宫颈癌是女性最常见妇科恶性肿瘤，发病率排女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌。目前已明确持续高危型HPV感染是其发病原因，但HPV致宫颈癌的具体发病机制及过程仍不清楚[1]。近年来自噬与肿瘤的关系引起了广泛关注。自噬是细胞内物质代谢的重要途径之一，它参与真核细胞的基础代谢，具有高度保守性，在细胞稳态及能量再利用方面发挥重要的作用。然而近些年研究表明，自噬调控机制的失活与恶性肿瘤的发生发展密切相关[2]。自噬相关基因1(Beclin1)是编码自噬相关蛋白的重要基因[3]。本研究通过检测Beclin1蛋白在宫颈癌中的表达情况，探讨其在宫颈癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选用2018年至2019年在江西省肿瘤医院妇瘤科行手术治疗的首诊宫颈癌患者40例，术中取宫颈癌组织及癌旁组织(距离癌组织>3 cm、经HE染色证实无癌细胞浸润的正常宫颈组织)。患者年龄36～66岁，平均年龄48岁。按照FIGO2018子宫颈癌分期标准：Ⅰ期32例，Ⅱa期8例。鳞癌30例，腺癌8例，特殊类型2例；中、高分化25例，低分化15例。5例淋巴结转移，35例无淋巴结转移。所有标本的采集均取得患者或家属的知情同意并经我院伦理委员会批准。

1.2 入组标准

①术前宫颈活检病理确诊为宫颈癌；②术前未行放化疗、免疫等肿瘤综合治疗；③没有合并其他组织器官原发恶性肿瘤。

1.3 试剂

Beclin1小鼠抗人单克隆抗体，购自Abcam公司；通用型二抗及DAB显色液，购自北京中杉金桥公司。

1.4 方法

采用免疫组化EnVision法染色，将切片脱蜡、水化，3%H2O2封闭：室温孵育30 min，高压热修复抗原，一抗Beclinl 4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇分化，脱水，透明，封固。实验用阳性乳腺癌标本作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.5 结果判断

Beclin1蛋白主要在细胞质中表达，阳性表达为淡黄色至棕褐色颗粒。按细胞染色强度评分，共分4级：不显色(0分)、浅黄色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)。每例随机观察5个高倍视野阳性区，计算阳性细胞所占百分比进行评分：阳性细胞率≤10%为1分，>10%～50%为2分，>50%为3分。最终将两者相乘，结果判定：0分为阴性(-)；1～3分为弱阳性(+)；4～6分为阳性(++)；9分为强阳性(+++)。(-)为阴性表达，(+)～(+++)均为阳性表达。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析，计数资料组间比较采用卡方检验，相关性分析采用 Bivariate(Spearman)等级相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin1免疫组化结果

本研究结果显示Beclin1蛋白主要在细胞质中表达，在宫颈癌组织中大多数表达呈阴性，少部分呈弱阳及中等阳性表达，极少部分(2例)强阳性表达，而在癌旁组织中大多数呈强阳性表达。Beclin1蛋白在宫颈癌及癌旁组织中阳性表达率分别为 42.5%(17/40)、95.0%(38/40)，差异有明显统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 Beclin1蛋白在宫颈癌及癌旁组织中的表达/例

2.2 宫颈癌组织中Beclin1蛋白表达及临床病理参数之间的关系

Beclin1蛋白表达阳性率与肿瘤形态及病理类型无明显相关性(P>0.05)，而与肿瘤的分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关(P<0.05)(表2)。

表2 宫颈癌组织中Beclin1蛋白表达与临床病理参数的关系/例

3 讨论

自噬是真核细胞中独有的生命现象，它能使细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质[4]。自噬在生理和病理生理方面均能调节细胞稳态，但该过程的功能障碍可导致细胞死亡。自噬可以作为一种替代性的细胞死亡机制，类似于某些条件下的细胞凋亡，这被描述为Ⅱ型程序性细胞死亡[5]。研究表明，自噬可通过清除受损细胞器、启动细胞程序性死亡来控制肿瘤细胞增殖，所以自噬可以保护我们生物体免受不同的疾病如感染、神经退行性病及癌症[6]。

随着恶性肿瘤的发展，它们与其微环境相互作用，并可激活自噬，这是一种分解代谢过程[7]。近年来，肿瘤与凋亡、坏死的研究层出不穷，肿瘤与自噬的相关性研究成了近些年研究的热点，相关研究甚多，目前自噬与恶性肿瘤的发生发展成为大家研究的焦点。一方面，研究表明自噬可以通过调节细胞内过氧化物的浓度、氧化应激水平、致瘤性突变积累等抑制肿瘤发生[8]，当然也有研究显示自噬在某些肿瘤中表现较高的活性。自噬如何影响肿瘤生长尚有争议。所以自噬研究在肿瘤的治疗上具有广阔的前景。研究表明[9]，自噬有望成为肿瘤治疗的潜在干预靶点，为广大恶性肿瘤患者治疗开拓新的治疗途径，真正提高恶性肿瘤患者的临床治愈率。

Beclin1作为重要的自噬相关蛋白，参与自噬和细胞凋亡，是胚胎发生和正常组织动态平衡所必需的。近年来，Beclin1的抗肿瘤作用受到越来越多的关注，它被鉴定为在自噬的溶酶体降解途径中起关键作用的肿瘤抑制蛋白。实验证据表明，Beclin-1单独抑制肿瘤形成、血管生成和转移，并与肿瘤抑制分子UVRAG，Bif-1，Ambra1和MDA-7/IL-24相互作用[10]。临床上在大约40%的前列腺癌，50%的乳腺癌和75%的卵巢癌中都观察到Beclin-1缺失[11-13]。为了深入研究Beclin1在宫颈癌患者病情进展中所起作用，本次研究通过检测宫颈癌组织、癌旁组织中Beclin1蛋白的表达情况发现：与癌旁组织相比，宫颈癌组织中Beclin1蛋白阳性表达率显著降低，说明Beclin1是抑癌相关基因，它的表达降低导致了宫颈癌的发生。同时对宫颈癌与临床病理进行相关分析，结果显示：Beclin1蛋白表达与宫颈癌肿瘤的浸润深度、组织学分级及淋巴结转移均密切相关，表现为肿瘤浸润深肌层、低分化、淋巴结转移患者中Beclin1阳性表达率下降更明显，与肿瘤的形态、病理类型无明显相关性。统计结果表明：癌组织及癌旁组织中Beclin1表达差异提示其与宫颈癌的发生有关，而在不同分化程度、浸润深度及淋巴结转移的差异表达提示其在宫颈癌的病情进展过程中扮演着重要角色，提示其与肿瘤的不良预后显著相关。Beclin1可作为宫颈癌恶性程度、复发转移的预测因子，临床上可作为评估患者预后的一项指标。

目前临床上几乎所有恶性肿瘤的治疗仍然是手术、放化疗、免疫靶向等综合治疗，早期患者预后相对良好，然而中晚期患者治疗效果差，生存期短。因此，在治疗恶性肿瘤的研究道路上，迫切需要我们不断地探索，寻求新的治疗方法。从目前对自噬的研究来看，诱导肿瘤细胞自噬性死亡有望为肿瘤治疗开拓新的治疗策略。宫颈癌晚期患者放化疗效果欠佳，一旦发生复发转移，化疗的效果非常有限，临床上对宫颈癌复发转移的治疗非常棘手，所以迫切需要研究新的治疗手段来改善晚期、复发性宫颈癌的治疗效果，所以目前对自噬与宫颈癌的研究及对自噬调控机制的进一步研究将为开发宫颈癌新的治疗策略提供理论依据。