木犀草素抑制有氧糖酵解对胃癌AGS细胞凋亡的影响

曾树宏，陆为民

（南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，严重危害着人类健康。随着社会发展、医学进步以及早癌筛查的推广，胃癌的发病率有所下降，但其总体发病率仍高居全球第三位，病死率居第四位［1-2］。目前胃癌的主要治疗手段仍以早期根治性手术、晚期全身化疗为主。有氧糖酵解，即Warburg 效应，是肿瘤细胞的特征性代谢方式，与三羧酸循环相比，糖酵解步骤少，产生ATP 效率低速率高，可以迅速满足肿瘤细胞疯狂增殖的能量需求；通过将大部分碳流由供能转变为合成生物大分子，可以维持肿瘤细胞持续增殖生长所需的物质储备，这使肿瘤细胞摄取葡萄糖和谷氨酰胺的速率是正常细胞的200 倍以上［3-5］。

木犀草素（Luteolin）是一种天然黄酮类化合物，木犀草素及其衍生物抗肿瘤研究主要聚焦于诱导凋亡、阻滞细胞，周期、抗血管生成等［6］。近期PALOMBO R等研究发现，木犀草素衍生物LUT-7-G 对HKⅡ有特异性抑制作用，导致有氧糖酵解作用下调，显示木犀草素衍生物在肿瘤能量代谢方面具有治疗潜力［7］。本研究拟通过体外实验研究木犀草素对胃癌AGS 细胞的凋亡诱导作用，通过有氧糖酵解途径探讨其可能作用机制，为木犀草素应用于胃癌治疗或协同增效提供依据。

1 材料

1.1 细胞

胃癌AGS 细胞系为江苏省中医院中心实验室常规培养。来源于中国科学院细胞库（上海），为中分化原位胃腺癌细胞。

1.2 木犀草素

木犀草素（纯度＞99%）购自南京道斯夫生物，采用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，配制为160 mol/L溶液。

1.3 试剂

乳酸（LD）试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；葡萄糖测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）；CCK-8（APExBio）；二甲基亚砜（APExBio）；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；β-肌动蛋白（β-actin）；己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）；丙酮酸激酶同工酶M2（PKM2）；葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）；半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）；半胱氨酸蛋白酶3 剪切体（Cleaved Caspase-3）；鼠、兔二抗（武汉塞维尔生物科技）。

1.4 仪器

CO2培养箱（HERA cell 1501 型）；生物安全柜（1300A2 型）；倒置相差显微镜（CKX51 型）；多功能酶标仪（ELx800 型）；电泳仪及转膜仪（北京六一）；凝胶成像仪（CHEMIDOC XRS+）。

2 方法

2.1 细胞培养

胃癌AGS 细胞复苏后，使用含10%小牛血清的RPMI-1640 培养基培养。培养于37 ℃、5%CO2及完全饱和湿度的细胞培养箱中。当细胞在培养皿中逐渐长至致密单层时，将细胞进行传代。

2.2 IC50测定

取对数生长期细胞，细胞计数调整浓度为（2～3）×104/mL，轻轻混匀，96 孔板每孔加入180 μL，待测细胞密度约为3 600～5 400/孔（边缘孔用无菌PBS 填充）；将接种好的细胞培养96 孔板放入CO2细胞培养箱，至细胞单层铺满孔底（通常过夜）。将20 μL不同浓度木犀草素培养基溶液加入孔内（稀释倍率以DMSO含量1/1 000 以下为标准）。5%CO2、37 ℃继续培养细胞，观察镜下药物作用效果。弃含药培养基，每孔加入100 μL CCK8 工作液，继续培养1～2 h。在酶标仪OD 490 nm 处检测各孔的吸光值，收集数据，进行分析，绘制量效曲线。

2.3 葡萄糖浓度测定

取对数生长期细胞培养基，1 000 rpm 离心5 min后，取上清待测；加入测定试剂，在酶标仪OD 570 nm处检测各孔的吸光值，用空白管调零，测定各管的吸光光度值（标准品理论浓度为5.55 mmol/L）；葡萄糖消耗量及消耗率按照公式计算。

2.4 乳酸浓度测定

配置酶工作液：试剂一（酶稀释液）和试剂二（酶储备液）按100∶1 体积比混合，现配现用（2～8 ℃，24 h 内有效）。配置显色剂：试剂四粉末1 支倒入1 瓶试剂三液体中，待粉末全部溶解，移入离心管中充分颠倒混匀，再重新移入瓶中，反复2～3 次，使二者充分混合（2～8 ℃避光保存，2 周有效），按照下面的次序依次配入。

①空白管：双蒸水20 μL + 酶工作液1 mL + 显色剂200 μL；②标准管：不同浓度的标准品20 μL（依次稀释为1、2、3、4、5、6 mmol/L）+酶工作液1 mL+显色剂200 μL；③测定管：待测样品20 μL + 酶工作液1 mL+显色剂200 μL。

混匀，37 ℃水浴精准反应10 min 后，每管加入终止液2 mL。在酶标仪OD 570 nm 处检测各孔的吸光值，用空白管调零，测定各管的吸光光度值。计算各管乳酸浓度。

2.5 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测相关蛋白表达

取对数生长期的胃癌AGS 细胞，调整细胞密度为1 × 105/mL，接种于6 孔板中，组别设置及加药情况同上，培养48 h，弃旧培养基，PBS 清洗，每皿加RIPA 裂解液100 μL，充分混匀裂解，吸取总蛋白匀浆，超声裂解后，4 ℃，12 000 rpm 离心20 min，收集上清，BCA 法测定总蛋白浓度，计算上样量。将提取的蛋白样品与5 × SDS 蛋白上样缓冲液按4∶1 体积比混匀，99 ℃煮蛋白10 min，按计算的上样量，加入合适浓度的SDS-PAGE 胶中进行电泳分离。电泳完毕后切胶转膜，转膜完成后，5%奶粉封闭1 h，分别加 入 相 应 一 抗（β-actin、HK Ⅱ、PKM2、GLUT1、Caspase-3、Cleaved Caspase-3），4 ℃孵 育 过 夜，TBST 洗膜4 次，每次10 min，加入相应种属来源的二抗中，常温缓慢摇床60 min。二抗取出后，TBST 洗膜4 次，每次10 min，ECL 特超敏液显影曝光检测蛋白表达情况。

2.6 统计学处理

Western Blot 采用Image Lab 软件分析灰度值，数据采用SPSS22.0 软件分析；数据采用均数± 标准差（±s）表示，满足正态分布和方差齐性的多组之间均数比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD 法；方差不齐者采用Dunnetts'T3 检验。P≤0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 木犀草素对胃癌AGS细胞系的体外抑制作用

观察木犀草素对胃癌AGS 细胞体外抑制作用并进行检测分析，计算木犀草素对胃癌AGS 细胞的IC50值为55.64 μmol/L，因此确定后续实验木犀草素低、中、高浓度分别为20、40、80 μmol/L。结果表明，木犀草素对胃癌AGS 细胞的增殖具有明显抑制效果。见表1和图1。

表1 木犀草素干预后各浓度胃癌AGS细胞存活率（±s）

表1 木犀草素干预后各浓度胃癌AGS细胞存活率（±s）

浓度（μmol/L）1.25 2.5 5 10 20 40 80 160细胞存活率（%）102.47±2.05 103.47±1.49 101.40±1.59 98.10±0.87 84.64±1.04 67.19±4.03 31.81±1.72 12.90±0.50

图1 木犀草素干预后胃癌AGS细胞存活率

3.2 木犀草素诱导胃癌AGS细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，在AGS 细胞系中，20、40 μmol/L 与空白对照组相比，无明显统计学意义，剂量升至80 μmol/L 时，凋亡率为（49.74±3.09）%，具有统计学意义（P ＜0.05）。见表2和图2。

图2 木犀草素干预后各组胃癌AGS细胞的流式细胞双参数散点图

表2 木犀草素干预后各组胃癌AGS细胞凋亡率（±s）

表2 木犀草素干预后各组胃癌AGS细胞凋亡率（±s）

注：与0 μmol/L比较，****P ＜0.000 1。

浓度（μmol/L）0 20 40 80凋亡率（%）6.53±1.30 10.39±0.89 11.38±1.06 49.74±3.09****

3.3 木犀草素对胃癌AGS 细胞有氧糖酵解水平的影响

通过对培养基中葡萄糖、乳酸浓度进行测定，计算葡萄糖消耗率及乳酸产量，对木犀草素对胃癌AGS 细胞的有氧糖酵解水平进行评估。结果显示，随着木犀草素浓度增大，葡萄糖消耗率不断减少，乳酸产量也不断减少（P＜0.01）。见表3。

表3 木犀草素干预后各组细胞葡萄糖消耗率及乳酸产量（%）

3.4 木犀草素对各组细胞相关蛋白表达量的影响

为进一步揭示木犀草素对胃癌细胞的促凋亡影响，本研究对凋亡相关蛋白Caspase-3，Cleaved Caspase-3进行检测，结果表明，随着木犀草素浓度增大，Caspase-3 表达越来越低，Cleaved Caspase-3 表达越来越高，其促凋亡作用越明显（P＜0.05）。随着木犀草素浓度升高，HKⅡ、PKM2、GLUT1 表达越来越低，呈现浓度依赖性（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。结果见图3和表4。

表4 木犀草素干预后各组细胞相关蛋白相对表达量（±s）

表4 木犀草素干预后各组细胞相关蛋白相对表达量（±s）

注：与0 μmol/L比较，**P ＜0.01，***P ＜0.001，****P ＜0.000 1。

浓度（μmol/L）0 20 40 80 Caspase-3/Cleaved Caspase-3 1.00±0.01 0.73±0.08***0.43±0.04****0.06±0.02****HKⅡ/β-actin 1.00±0.02 0.96±0.03 0.93±0.02 0.78±0.05**PKM2/β-actin 1.00±0.04 0.93±0.05 0.65±0.09***0.34±0.05****GLUT1/β-actin 1.00±0.03 0.82±0.06***0.41±0.07****0.21±0.04****

图3 木犀草素干预后各组细胞相关蛋白表达量

4 讨论

细胞代谢是一切生命体生存的基础，细胞从环境获取营养物质，通过一系列的反应，将营养物质转化为支持细胞各种功能的代谢产物。在正常氧条件下，正常细胞主要通过线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的三羧酸循环（TCA cycle）产生ATP；而肿瘤细胞即使氧气充足的情况下，也依赖糖酵解产生ATP来提供能量，大部分的碳链用于合成生物大分子，以维持肿瘤细胞高速增殖速率［8］。

肿瘤细胞特征性的有氧糖酵解现象，即为“Warburg现象”，由Otto Warburg首次提出［9］。动物细胞在正常情况下，对血液中葡萄糖的摄取受到严格的控制。各类生长因子，比如胰岛素（Insulin）、血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子（EGF），是指导细胞摄取葡萄糖的主要信号；与受生长因子调控的增殖的正常细胞不同的是，大多数肿瘤细胞为了补偿糖酵解这种低效的产能方式，通过基因的突变激活自主摄取葡萄糖的能力，从而使获得的葡萄糖比它们自身氧化代谢所需的葡萄糖多得多，因此肿瘤是一种消耗性疾病［10-12］。本研究中，实验证实木犀草素可诱导胃癌AGS 细胞凋亡，其凋亡机制可能与木犀草素下调有氧糖酵解途径有关。