食管鳞癌相关成纤维细胞的原代培养及其促癌作用研究

兰子君，郭静宜，刘 轲,，孔金玉，高社干,

食管癌(esophageal cancer,EC)是全球发病率排名第七(3.2%)、死亡率排名第六(5.3%)的恶性肿瘤[1]。我国是全球食管癌发病及死亡的重灾区，国家癌症中心最新数据显示，2015年我国食管癌发病人数为24.6万人，死亡人数则高达18.8万人，其中约有90%为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]。由于患者早期症状不明显，多数ESCC确诊时已属晚期，尽管近年来在诊断和治疗方面取得了许多新的进展，但预后仍不尽如人意，5 a生存率较低。手术切除结合新辅助化疗是目前治疗ESCC最常用的策略之一，而对化疗的耐药性仍是晚期ESCC患者治疗失败的主要原因[3]。因此，寻找ESCC早期筛查诊断、预后评估的新指标，揭示ESCC的潜在耐药机制，发现新的药物靶标，对于ESCC的防控和诊治至关重要。

肿瘤被认为是“无法愈合的伤口”，肿瘤的发生发展不仅与恶性细胞本身有关，还取决于肿瘤的微环境(tumor micro-environment,TME)[4-7]。成纤维细胞是肿瘤基质中分布最广、最为丰富的细胞组分，活化的成纤维细胞被称为肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)，是介导肿瘤与基质间相互作用的最为重要的基质细胞之一。大量证据表明，CAFs在肿瘤演变过程中扮演着重要角色[8-11]。近年来，CAF已成为肿瘤研究的热点，并有希望成为新的预后标志物和抗肿瘤治疗靶标。

本研究通过采用两种不同的原代培养方法建立了ESCC相关CAFs细胞系，建立了成纤维细胞与食管癌KYSE150细胞细胞系的体外共培养模型，在此基础上通过细胞功能学实验对ESCC相关CAF的促癌作用进行了初步的研究，为后续的理论和实验研究奠定基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

CO2培养箱(Thermo Fisher，美国)；MACS组织处理器(Miltenyi Biotec，德国)；激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss AG，德国)；多功能酶标仪(PerkinElmer，美国)；流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)。

选取2019年9月至2020年5月于河南科技大学第一附属医院行食管癌根治术、病理确诊为食管鳞癌的患者6例，经患者签署知情同意书，医院伦理委员会批准，取新鲜肿瘤组织及癌旁食管黏膜组织6例(取材距癌灶>5 cm)进行原代培养。人食管癌细胞系KYSE150购自中国科学院细胞库。

RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、青链霉素均购自北京索莱宝科技有限公司；MACS组织解离试剂盒购自德国Miltenyi Biotec公司；细胞增殖与活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自日本同仁化学研究所；流式凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen公司；激光共聚焦培养皿、Transwell小室及细胞培养相关耗材均购自美国Corning公司；兔一抗波形蛋白(Vimentin)，细胞角蛋白(CK19)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)均购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养选择人食管癌细胞系KYSE150，采用含10%FBS的RPMI-1640完全培养基，在37 ℃、5%CO2的CO2培养箱中进行培养；按1∶4比例传代培养，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 组织块贴壁法原代培养成纤维细胞术后30 min内分别取直径为1 cm的新鲜肿瘤组织及其对应癌旁食管黏膜组织，生理盐水洗净后放入10×双抗培养基，冰上运输，10×双抗4 ℃浸泡过夜。4×双抗培养基浸洗3次，每次5 min，同时切除坏死部分。培养瓶预先以少量FBS浸润，将组织剪成直径0.1 cm、大小均匀的组织块，以0.5 cm间距均匀铺放于25 cm3培养瓶底部。倒置培养瓶，加入含4×双抗，20%FBS的RPMI-1640培养基，倒置于37 ℃、5%CO2的培养箱，静置12 h后翻转。48 h后镜下观察，若有细胞爬出后，以含4×双抗，20%FBS的RPMI-1640培养基继续培养。

1.2.3 组织解离法原代培养成纤维细胞术后30 min内取直径1 cm的新鲜ESCC肿瘤组织及其对应癌旁食管黏膜组织，生理盐水洗净，放入10×双抗培养基，4 ℃浸泡过夜。4×双抗培养基浸洗3次，去除坏死部分，剪碎，使用MACS组织处理器以及MACS组织解离试剂盒对组织进行解离。将细胞悬液加入含4×双抗和20%FBS的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中进行原代培养。待细胞达到80%～90%融合，采用连续贴壁法进行纯化传代，纯化3次后获得成纤维细胞，并通过细胞免疫荧光法进行鉴定。实验用原代培养成纤维细胞传代培养不得超过8代，以免其生物学功能发生改变影响实验结果。

1.2.4 细胞免疫荧光制作细胞爬片，4%甲醛固定，0.2% TritonX-100透化，5%BSA封闭，一抗α-SMA(1∶500)，CK-19(1∶500)，Vimentin(1∶500)4 ℃孵育过夜，荧光二抗(1∶1 000，thermofisher)室温孵育2 h，DAPI核染色，激光共聚焦显微镜观察拍照，甘油封片，避光保存。

1.2.5 CCK-8绘制细胞生长曲线细胞消化重悬计数，接种于96孔板(每孔100 μL)，每孔3 000个，每组设置3个复孔，进行常规培养，根据实验设置，在不同时间点终止培养，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育1 h，使用多功能酶标仪检测450 nm处的吸光值，根据每个时间点的OD值绘制细胞生长曲线。

1.2.6 体外共培养模型与细胞功能实验使用0.4 μm孔径的Transwell小室将两种细胞进行间接共培养，按照1∶2的比例，将效应细胞CAFs接种于Transwell小室中，靶细胞KYSE150接种于配套的细胞培养板中。细胞培养箱过夜培养后，将Transwell小室和培养板中培养基去除，培养板下室加入新的培养基，将Transwell小室放入细胞培养板中并加入新的培养基，培养48～72 h后进行后续实验。用于划痕实验时，采用6孔板配套Transwell小室，直接在6孔板底部划痕，PBS洗净并换用无血清培养基，分别于0、8、16、24 h对同一位置进行拍照，使用ImageJ软件测量划痕面积，统计伤口愈合百分比，分析细胞迁移能力差异。对于Transwell检测肿瘤细胞侵袭能力的实验，以1∶2的比例将ESCC细胞系接种于预铺基质胶的8.0 μm孔径的Transwell小室中，CAFs接种于配套的24孔板中，建立共培养体系，24～48 h后用4%多聚甲醛固定、结晶紫染色，拍照计数进入下室的细胞量，以评估不同分组ESCC的侵袭能力。

2 结果

2.1 两种原代培养方法培养效果评估

分别采用组织解离法和组织块贴壁法对6对ESCC患者肿瘤及其癌旁组织进行原代培养，每日观察，记录细胞爬出时间、长满培养瓶80%～90%时所需时间，并观察细胞形态，评估培养效果。见表1。采用组织块贴壁法培养，起初以上皮样细胞为主，后期成纤维细胞优势生长，上皮样细胞生长受到抑制，逐渐凋亡脱落；采用组织解离法培养，上皮样细胞与成纤维细胞混杂生长，以成纤维细胞为主。见图1。

表1 两种原代培养方法效果评估

图1 两种方法培养细胞爬出与长满状态(40×)

2.2 成纤维细胞镜下形态及生长曲线绘制

经连续贴壁法对原代细胞进行纯化传代3次，镜下观察两种细胞，可见原代培养所得CAFs与PTFs均呈长梭形或星形，排列呈条索状，呈放射状或漩涡状生长，符合成纤维细胞特点。相较PTFs而言，CAFs体积大小不一，突触增多，排列无方向性，部分区域细胞重叠生长，接触抑制与密度抑制消失。见图2。

图2 原代CAFs与PTFs镜下形态

通过CCK8法检测两者增殖活性，在相同培养条件下将等量细胞(每孔3×103)接种于同一96孔板，每隔12 h进行一次CCK-8孵育检测，根据不同时间点OD 450 nm吸光值绘制细胞生长曲线。结果显示，CAFs增殖速度较快，而PTFs生长缓慢，CAFs增殖能力明显强于PTFs(P<0.05)。见图3。

①P<0.01。

2.3 免疫荧光鉴定成纤维细胞

波形蛋白(Vimentin)是成纤维细胞特异性标志物，而细胞角蛋白-19(CK-19)是鳞状上皮细胞癌的特异性标志物，两者可用于鉴别成纤维细胞与上皮来源肿瘤细胞。通过免疫荧光法初步鉴定原代细胞中两种标志物的表达情况，结果显示，两种细胞皆为Vimentin阳性，CK-19阴性，说明两者均为成纤维细胞。α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是成纤维细胞活化的典型标志物，免疫荧光结果显示，CAFs为α-SMA高表达细胞，PTFs为α-SMA弱表达细胞，证实本研究从ESCC肿瘤组织中分离出的成纤维细胞确为活化状态的成纤维细胞，即癌相关成纤维细胞。见图4。

图4 免疫荧光鉴定CAFs与PTFs(100×)

2.4 CAFs促进ESCC细胞系侵袭迁移

在共培养条件下，采用划痕、Transwell 检测两种成纤维细胞对KYSE150细胞系迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响。实验分为对照组(150-BLANK)、CAF共培养组(150+CAF)与PTF共培养组(150+PTF)。结果显示，两种成纤维细胞对于KYSE150迁移行为均具有促进作用，CAFs对于KYSE150迁移行为的促进作用更为显著(P<0.05)。见图5。两种成纤维细胞对于KYSE150侵袭能力均具有促进作用，CAFs对于KYSE150侵袭能力的促进作用更为显著(P<0.05)。见图6。由此可得，与PTFs相比，ESCC相关CAFs对于ESCC细胞迁移、侵袭行为具有显著促进作用。

①P<0.01；②P<0.001。

①P<0.01；②P<0.001。

3 讨论

作为肿瘤基质的主要组成部分，CAFs在肿瘤演变过程中扮演着重要角色[8]。CAF介导EMT、代谢重编程、癌症干细胞(cancer stem cells,CSC)的诱导，促进肿瘤免疫逃逸、表观遗传学修饰、DNA损伤修复、自噬调节等，都与肿瘤进展和耐药机制密切相关[9-12]。但是，对CAF在ESCC中的作用的研究并不充分，并且促进ESCC进展的具体机制仍然未知。通过建立ESCC细胞系与成纤维细胞共培养体系，本研究发现ESCC相关CAFs可显著促进ESCC细胞的迁移、侵袭行为，这与多种其他类型肿瘤的研究结果相类似，而CAF促进ESCC进展的机制仍需进一步研究。

永生化的成纤维细胞细胞系或经10次以上传代的原代培养成纤维细胞，其生物学特性可能发生变化，不利于后续实验进行。所以，在CAF体外细胞功能学研究中，需要对CAF进行原代培养并保证实验用原代培养成纤维细胞为纯化后的P3-P8代。本研究发现组织块贴壁法原代培养成纤维细胞纯度优于组织解离法，但是程序复杂，对人员操作水平要求较高，成功率低。组织解离法原代培养操作简便，培养成功率更高，细胞生长更快，但是试剂耗材成本较高。为了建立稳定的成纤维细胞原代培养体系，本研究采用组织解离法，成功地从6例ESCC组织及其癌旁组织中分离出了6例CAFs与5例PTFs。此外，由于食管本身的开放性，组织极易被细菌、真菌污染，原代培养对于样本的无菌要求极高，所以必须在离体30 min内对组织进行采样洗涤，并及时浸泡在含10×双抗的培养基中，冰上运输，10×双抗浸泡过夜，这些措施都是为了尽量减少组织污染的可能性，提高原代培养成功率。

本研究建立了稳定的原代培养成纤维细胞体系，通过细胞共培养体系验证了CAF对ESCC的促癌作用，为后续有关ESCC肿瘤微环境中CAF的理论和实验研究奠定了基础。