新疆密点麻蜥mtDNA Cytb基因系统进化分析

钟 文，李 铀，2，韩 晨，谢 慧，陈伟基*

（1．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2．西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州730030）

麻蜥亚属（Eremias）是为区分蜥蜴亚属（Lacerta）而建立的，在指定敏麻蜥（Eremias arguta）为麻蜥属的模式种后，亚属被提升为属，并入Eremiae科[1]。全世界有麻蜥50余种，广泛分布于亚洲、欧洲、非洲的温带和暖温带[2]。赵尔宓等[3]在2000年校正过中国两栖纲（Amphibian）和爬行纲（Reptilia）动物名录，认为国内麻蜥有9种，主要分布于东北、西北和华北。密点麻蜥（Eremias multiocellata）是我国荒漠草原和半荒漠草原最常见的卵胎生蜥蜴，在生态系统中属于消费者，保证能量遵循食物链和食物网逐级流动，在荒漠化草原生态系统中起着举足轻重的作用[4]。因此，对密点麻蜥群体进行系统进化分析，对后续合理利用及种质资源保护工作有重要意义。

遗传多样性是生物进化和适应环境的基础，种群遗传多样性的缺乏对该物种的生存是巨大的威胁[5]。线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是动物细胞唯一一种核外遗传物质，因分子量小、进化速率快、无重组、母系遗传等特性，是研究亲缘物种遗传关系及起源进化的理想分子标记[6]。线粒体基因组中共有37基因，有13个蛋白编码基因，其中细胞色素b基因（Cytochrome b，Cytb）因结构和功能较为清楚，所以被广泛应用于物种鉴定、分子进化、系统地理学和遗传结构研究[5,7]。近年来对密点麻蜥的研究越来越多，如食性[8]、环境[9-10]、两性异型及繁殖[1]、分子方面[11-12]等，但在Cytb基因上对于密点麻蜥的研究不多。因此，本研究利用Cytb基因，对密点麻蜥进行系统发育分析，并探讨与国内的几种麻蜥的遗传关系，补充和丰富新疆地区密点麻蜥的基础遗传数据，为保护该地区内其他物种提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究的密点麻蜥样品采自新疆维吾尔自治区南部的5个地区，具体样品信息及从Genbank上获取的样品序列号见表1。

表1 样品信息及Genbank序列号Tab.1 Sample information and GenBank serial number

1.2 基因组DNA提取

使用通用型基因组DNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行基因组DNA的提取，并放置于-20℃冰柜保存，备用。

1.3 引物设计与PCR扩增

根据Genbank公布的密点麻蜥线粒体DNA全序列（序列号为KM257724.1），使用软件Primer Premier 5.0[13]进行引物设计，上游引物：CytbF（5'-ACATACGAAAA CAACATCCAATCT-3'），下游引物：CytbR（5'-TTATTTTCTAGGGTGGCGGCT-3'）。引物由宝生物工程（大连）公司合成。

使用设计的引物对本次密点麻蜥样本进行线粒体Cytb基因的扩增。通过试验，建立的最佳PCR扩增体系（25μL）：2×Pro Taq Master Mix（dye plus）12.5μL、5μmol/L上下游引物0.5μL、密点麻蜥基因组DNA 2μL、ddH2O 9.5μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共循环35次；72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经1.4%琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测。检测合格的扩增产物由兰州天启基因生物科技有限公司进行测序。

1.4 数据统计与分析

采用Geneious 2020.2.5（http://www.geneious.com）处理测序结果原始ABI文件，经过人工校对后获得18条密点麻蜥Cytb基因样本序列。下载Genbank上已发表的38条中国麻蜥[荒漠麻蜥（Eremias przewalskii）、天山麻蜥（Eremias stummeri）、丽斑麻蜥（Eremias argus）、虫纹麻蜥（Eremias vermiculata）、快步麻蜥（Eremias velox）、山地麻蜥（Eremias brenchleyi）]序列及2条南疆沙蜥序列作为外群的物种序列，见表2。

表2 物种名称及Genbank序列号Tab.2 Species name and GenBank serial number

续表2 物种名称及Genbank序列号Tab.2 Species name and GenBank serial number

将所得密点麻蜥Cytb基因序列与下载的40条蜥蜴序列用MEGA-X[14]进行对比，然后采用邻接和最大似然法分别构建系统进化树进行系统发育分析。NJ法与ML法构建的进化树Bootstrap置信值均为重复抽样1 000次。

2 结果与分析

2.1 Cytb基因测序结果

各个样品最终序列均在1 000～1 200 bp之间，测序结果经软件Geneious 2020.2.5拼接并人工校对后获得Cytb基因，长度为989 bp。

2.2 Cytb基因密点麻蜥的系统发育分析（见图1、图2）

图1 NJ系统发育树Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree

图2 ML系统发育树Fig.2 Maximum Likelihood phylogenetic tree

利用MEGA-X软件，应用邻接法（NJ）构建了密点麻蜥与其他麻蜥Cytb基因的NJ进化树，进化树Bootstrap置信值为重复抽样1 000次。

由图1可知，从种群间看，5个地区18个密点麻蜥样本均在同一分支，每个地区样本几乎均是独立分支，喀什地区的密点麻蜥与同市叶城和塔什库尔干的密点麻蜥亲缘关系最近，但喀什地区的M13稍有偏离，与乌恰的密点麻蜥属于同一分支。从品种间看，密点麻蜥与其余6种麻蜥在同一分支上，其中与荒漠麻蜥的亲缘关系最近，天山麻蜥次之，亲缘关系最远的是山地麻蜥。南疆沙蜥作为外群，独立于另一分支上。

图2是基于Cytb基因运用MEGA-X软件中的MODELS功能，通过计算找到此次最大似然法构建进化树的最佳模型为Hasegawa-Kishino-Yano，而构建成的ML进化树，该进化树Bootstrap置信值为重复抽样1 000次。

由图2可知，结果与NJ进化树的结果基本一致，南疆沙蜥独立于1个分支，所有麻蜥在1个分支上，其中与山地麻蜥的亲缘关系最远，荒漠麻蜥的亲缘关系最近。密点麻蜥种群间每个地区样本几乎都是独立分支，喀什地区的密点麻蜥与民丰的密点麻蜥亲缘关系最远，乌恰次之，与同市叶城和塔什库尔干的密点麻蜥亲缘关系最近。但是，喀什地区的M13稍有偏离，与乌恰的密点麻蜥属于同一分支。

3 讨论

遗传多样性是物种长期进化或群体持续生存并适应不断变化环境而进化的结果，物种遗传多样性或变异性越丰富，表明物种的进化潜力越大，对环境改变适应的进化能力越强[15]。研究物种遗传多样性对于评估物种资源状况，制定野生物种资源保护策略等方面具有重要意义[5]。线粒体Cytb基因具有较高的进化速率，是研究种间遗传多样性和系统发育关系的主要分子标记之一。

本研究基于Cytb基因采用邻接法（NJ）和最大似然法（ML）构建的两种进化树结果几乎一致，通过分析可知，首先，在密点麻蜥种群中，5个地区共计18个样本均在1个分支上，喀什地区的密点麻蜥与同市的叶城和塔什库尔干的密点麻蜥亲缘关系最近，乌恰亲缘关系次之，与民丰地区的亲缘关系最远。每个地区的样本几乎单独在1个小分支上，但是喀什地区的M13样本被分到乌恰地区的分支上，表明这两个地区的密点麻蜥可能存在基因交流。第二，从品种间看，密点麻蜥与所有麻蜥在1个大分支上，其中与密点麻蜥亲缘关系最远的是山地麻蜥，而后依次为快步麻蜥、虫纹麻蜥、丽斑麻蜥和天山麻蜥，荒漠麻蜥则是与其亲缘关系最近的品种。本研究与前人的研究结果相似，以往研究表明，虽然两种蜥蜴的形态学差异很大，但密点麻蜥与荒漠麻蜥的遗传距离很小，甚至低于亚种水平[2,12]。南疆沙蜥区别于所有麻蜥，单独占据1个大分支，虽然其与密点麻蜥不同属，遗传距离也最远，但其之间是否存在基因交流的个例无法确定，有待进一步研究。

4 结论

本研究对新疆南部5个地区密点麻蜥的线粒体基因Cytb进行扩增测序，基于Cytb基因与中国6种麻蜥和南疆沙蜥构建系统进化树，发现密点麻蜥种群间存在基因交流，密点麻蜥和荒漠麻蜥间可能存在基因流动，即可能存在杂交现象，但目前的数据无法证明这一点。本研究补充和丰富了新疆部分地区密点麻蜥的基础遗传数据，为后续合理利用及保护该地区内其他物种的种质资源奠定基础。