超高效液相-离子阱质谱法测定保健食品与中成药中非法添加的10种禁用激素

王卫钢,岳磊（.河南省周口市公共检验检测中心（周口市食品药品检验所）,河南 周口 466000;2.郑州市食品药品检验所,河南 郑州 450000）

雌激素和孕激素是由女性卵巢分泌的最基本的两个激素，也是直接导致女性在生理体征上有别于男性的最本质的激素[1-2]。常见用于辅助治疗青春期子宫异常出血、痛经；更年期抑郁症、心律失常、骨质疏松等疾病[3-7]。针对于检测雌激素及孕激素类的非法添加的分析方法中，液质联用法是近期研究的一种主要方向[8]。在此基础上，我们在质谱端采用线性离子阱（QTrap）技术，利用多反应监测（MRM）的定量数据，在质谱方法中添加相关信息扫描（IDA）与增强离子扫描（EPI），在浓度更低的样品基础上，提取更多的质谱信息数据，为更准确的定性提供有效参考。

1 材料

1.1 仪器 超高效液相色谱仪，型号：ACQUITY UPLC（美国Waters）；线型离子阱质谱分析仪，型号：4000 QTrap（美国Sciex）；电子分析天平，型号：XS205DU（瑞士Mettler Toledo）；超声波清洗机，型号：SB-800DTD（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试剂 对照品：黄体酮（批号：10027-201209，纯度：99.7%），雌二醇（批号：100182-201205，纯度：96.3%），雌三醇（批号：100934-201302，纯度：97.6%），雌酮（批号：100949-200501，纯度：100.0%），己烯雌酚（批号：10033-201308，纯度：99.5%），戊酸雌二醇（批号：100063-200904，纯度：99.6%）、苯甲酸雌二醇（批号：100006-200504，纯度：100.0%）、尼尔雌醇（批号：100239-200702，纯度：99.4%）、炔诺孕酮（批号：100028-199907，纯度：99.4%）、庚酸炔诺酮（批号：100988-200901，纯度：99.4%）均来自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件 色谱柱：C O R T E C S U P L C C18（2.1mm×50mm，1.6μm）；流动相：乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脱程序（0-3min，20%→90%A；3-4min，90%A；4-4.1min，90%→20%A；4.1-5min，20%A）；流速：0.3ml/min；柱温：30℃；进样量：1μl。电喷雾离子源（ESI）；正离子模式，MRM-IDA-EPI模式扫描。

2.2 对照品溶液的配制

2.2.1 对照品储备液 分别称取上述所有对照品各10mg（精确到0.01mg），分别置于100mL容量瓶，加少量甲醇，震摇使其溶解后再加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.2.2 标准曲线溶液配制 取上述各对照品储备液适量，制成浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0以及50.0μg·mL-1的对照品溶液。

2.3 样品处理 胶囊剂取10粒，将内容物完全倒出，研细混匀，备用；片剂取10粒，研碎后混匀，备用。取样品约1g（精确到0.0001g）置于50mL容量瓶中，精密加入甲醇20.0mL，超声处理30min后放置至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

2.4 结果 10种对照品的采样离子对及相关质谱信息参数见表1，其总离子流色谱图（TIC）见图1，各化合物增强离子扫描（EPI）子离子全扫图见图2。在检测样品拥有目标对照品时，可提取出样品的二级子离子图与对照品进行比对，能够提供对比出峰时间、离子丰度比之外的另一种验证方式。

表1 10种对照品质谱条件优化结果与方法学考察

图1 10种对照品的TIC色谱图。01.雌三醇；02.雌二醇；03.雌酮；04.己烯雌酚；05.炔诺酮；06.黄体酮；07.尼尔雌醇；08.苯甲酸雌二醇；09.戊酸雌二醇；10.庚酸炔诺酮

图2 10种对照品的EPI子离子图。01.雌三醇；02.雌二醇；03.雌酮；04.己烯雌酚；05.炔诺酮；06.黄体酮；07.尼尔雌醇；08.苯甲酸雌二醇；09.戊酸雌二醇；10.庚酸炔诺酮

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围 取标准曲线溶液与对照品储备液按上述条件测定，以待测物的峰面积（y）为纵坐标，以待测物质浓度（x，μg·mL-1）为横坐标作定量工作曲线，得到线性回归方程，结果表明，10种雌激素及孕激素对照品的溶液浓度与测得的峰面积呈良好的线性关系，相应的浓度范围内相关系数均大于0.999。具体结果详见表2。

表2 10种化合物的检出限、定量限、线性范围、回归方程和相关系数

2.5.2 精密度试验 取“2.2”项下各对照品储备溶液各5mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，照“2.1”项下条件连续进样6次，结果显示10种化合物（按表1中顺序）峰面积的RSD分别为3.0%、3.2%、3.0%、3.8%、1.9%、3.2%、3.1%、2.8%、2.1%、3.6%，表明仪器的精密度符合要求。

2.5.3 稳定性试验 随机选取“2.5.2”项下一份混合溶液，避光放置0、2、4、6、8、12h后分别进样，结果各成分的RSD分别为4.1%、4.8%、4.3%、2.1%、3.5%、3.2%、2.3%、2.6%、2.1%、2.1%，表明该供试品溶液样品在室温下12h内稳定性符合要求。

2.5.4 回收率 取同一批健字号胶囊，精密称取其颗粒细粉0.50g，精密加入2.2项下各标准储备液0.30ml，制备6份加标供试品溶液的平行样，计算加样回收率，结果显示，各成分的平均加样回收率分别为98.7%、99.5%、102.7%、96.4%、97.9%、96.3%、105.7%、101.5%、99.6%、102.1%，其RSD分别为2.4%、2.9%、3.6%、4.6%、5.9%、2.7%、3.1%、2.4%、4.5%、3.3%。

2.6 结果判断 若供试品色谱图出现与对照品对应离子对信号保留时间均一致的色谱峰，判断其离子丰度比是否与对照品一致，再调用二者EPI图谱确认二者碎片离子分布及强度均一致，则可准确定性供试品中的添加成分并予以定量分析。

2.7 实际样品测定 按照“2.3”所述方法对2018-2020年度郑州市安全评价性抽样的72批抽检样品进行处理，按照“2.6”项下方法进行判断，结果显示各样品中这10种化合物均未检出，说明抽检的保健食品及中成药中暂时未发现这10种化合物的非法添加安全隐患。

3 讨论

3.1 色谱条件优化 流动相：考察甲醇-水、乙腈-水体系在不同梯度下的表现。其中乙腈-水体系可以在最终检测时取得更好的峰型与分离度；采用梯度洗脱使得在总检测时间5min内保证目标化合物全部出峰，并基本实现基线分离，有效的减少了检测时间，提高了工作效率。

3.2 质谱条件优化 在仪器自动优化的前提下，选择适当的浓度采用手动优化的方法对各化合物的质谱条件进行了进一步的调整。利用仪器的线性离子阱（Q-Trap）功能在第三重四级杆处进行离子富集扫描，可以在较低浓度条件下生成二级子离子全扫描图，在定性时可以进行有效的辅助判断。以此为基础，未来可以在选择更多的激素类化合物对检测方法进行补充，以进一步扩大该检测方法的适用范围。