黑蒜多糖的超声波辅助提取及其降血糖作用研究

侯演林，李天娇，李 慧，羊玺月，丁予虹，邹润琪，程碧君

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132101）

大蒜为百合科植物葱蒜属蒜的地下根茎，含有丰富的营养元素，但口味辛辣，大蒜发酵制品如黑蒜能减轻辛辣口感。黑蒜是新鲜大蒜在温度为40～45 ℃，高湿度的发酵箱中发酵60～90 d 制成的。大蒜通过自体酶发生美拉德反应在高湿条件下制成黑蒜[1]，黑蒜保留了鲜蒜的营养成分（如蛋白质、氨基酸、维生素等），同时减轻了鲜蒜的辛辣刺激，具有很好的抗氧化[2-3]、降血糖、降血脂和杀菌消炎[4]等生理功能。

黑蒜中丰富的营养成分及特有的多糖结构使黑蒜具有降血糖、降血脂、抗疲劳、抗氧化等功效[5-7]；黑蒜多糖所含的硫酸基和糖醛酸使其具有较强的抗氧化能力[8]。近年来糖尿病发病率逐年升高，注射胰岛素对人体有明显副作用，黑蒜多糖降血糖的研究报告相对较少，因此探讨黑蒜多糖的降血糖作用非常必要。本实验通过改进水提醇沉的方法加以超声波辅助提取黑蒜多糖的工艺来提高多糖提取率[9-12]，超声波将黑蒜细胞壁破碎及引起次级效应，加快还原糖溶出，使提取液中还原糖的含量升高[13-14]。

本研究拟用有机溶剂无水乙醇溶解提取物中的脂溶性杂质来提高多糖提取率[15]。提取的黑蒜多糖溶于水制成不同浓度的溶液，用于动物实验[16]，探究黑蒜多糖的降血糖作用，为促进黑蒜保健食品的开发、拓展黑蒜的应用范围提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

JJ-124BF 型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TG-WS 型台式高速离心机，上海豫明仪器有限公司；HH-6 恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司；S1411C 干燥箱，日本Yamato（雅马拓）大和株式会社；LW-2008 低温超声波萃取仪，上海利闻科学仪器有限公司；多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司；血糖仪、试纸、针头，杭州微泰医疗器械有限公司。

1.2 材料与试剂

黑蒜，山东金乡县久红食品有限公司。

无水乙醇、甲醇、蔗糖，天津市致远化学试剂有限公司；氢化可的松，华中药业股份有限公司；三氯甲烷，天津市永大化学试剂有限公司；正丁醇，天津市大茂化学试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 试验流程

黑蒜→切块粉碎（过60 目筛）→脱脂→超声波辅助提取→黑蒜多糖含量测定→离心提取上清液→浓缩→蛋白除杂→酒精沉淀→离心取沉淀→干燥→高糖小鼠模型的建立→小鼠灌胃30 d→测定血糖[17]。

1.3.2 黑蒜多糖的超声波辅助提取

将黑蒜去皮后切片，用蒸馏水冲洗2 min，干燥箱内60 ℃干燥24 h，冷却至室温，粉碎，过60 目筛，将过筛后的黑蒜粉末用三氯甲烷∶甲醇（2∶1）混合溶液浸泡2 h，浸泡2 次，进行除脂。过滤，收集沉淀物，精密称取20 g沉淀物于锥形瓶中，加入100 mL 蒸馏水，按照料液比1∶10（g/mL）、提取温度55 ℃、提取时间30 min、超声功率400 W 进行提取。将超声提取后的样品经九层纱布过滤，将滤液浓缩至五分之一成为浓缩液，加入浓缩液3 倍体积的sevage 试剂（氯仿∶正丁醇=5∶1），除去浓缩液体中的蛋白。将混合液体在3 500 r/min 离心10 min，离心3 次，离心沉淀物加入3 倍于浓缩液体积的无水乙醇，进行沉淀放置12 h 后，将上清液扔掉，并将剩余沉淀物在4 200 r/min 下离心15 min，用无水乙醇洗涤沉淀物3次，沉淀物置于55 ℃恒温干燥箱中干燥12 h 至恒质量，得到黑蒜多糖[18]。用电子天平进行精确称量，记录数据。

1.3.3 黑蒜多糖提取率测定

采用苯酚-硫酸法测定黑蒜多糖的提取率。量取10 mg/mL 葡萄糖标准液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分别定容至100 mL 容量瓶中，量取2 mL 标准液向其中加入1 mL 6%苯酚溶液和4 mL 浓硫酸溶液，置于40 ℃水浴锅中40 min 后，冷却至室温，用紫外分光光度计在490 nm 下测定吸光度值，绘制标准曲线。

配制黑蒜多糖供试液，按照式（1）（2）计算黑蒜多糖提取率。

式中，c-多糖中葡萄糖浓度，mg/mL；V-定容的体积，mL；n-溶液稀释倍数；m-黑蒜粉末质量，g。

1.3.4 单因素试验

分别进行料液比、提取时间、提取温度、超声功率四个因素对黑蒜多糖提取率影响的单因素试验。准确称取20 g 处理后的黑蒜粉末，在55 ℃、400 W 的条件下提取30 min，料液比设置为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），以黑蒜多糖提取率为评价指标，优化料液比。同理，提取时间分别设定为20、25、30、35、40 min，提取温度分别设定为45、50、55、60、65 ℃，超声功率分别设定为250、300、350、400、450 W，计算黑蒜多糖的提取率。

1.3.5 正交试验

在单因素试验的基础上，对料液比、提取时间、提取温度、超声功率这4 个因素进行L9(34)正交试验，试验设计见表1。

表1 黑蒜多糖超声辅助提取的正交试验设计Table 1 Orthogonal test design for assisted ultrasonic extraction of black garlic polysaccharide

1.4 黑蒜多糖的降血糖作用研究

1.4.1 高血糖小鼠动物模型的建立

采用高血糖饲料（70%鼠饲料、15%氢化可的松、15%蔗糖）饲养小鼠，每组6 只试验小鼠，同时饮用15%的蔗糖水溶液辅助促进小鼠血糖的升高。经血糖仪测定高血糖小鼠血糖平均值大于6.9 mmol/L 时，符合高血糖条件（正常小鼠血糖值为5.6 mmol/L），此时完成了高血糖小鼠动物模型的建立。

1.4.2 动物试验

选取昆明小鼠30 只，要求肢体完好、健康活泼、体质量20～25 g，对体质量进行称量并记录，全部为雄鼠，随机分配。试验设多糖提取液低剂量组、中剂量组、高剂量组、高血糖对照组、空白组。低剂量组的黑蒜多糖溶液浓度为2 mg/mL，中剂量组为20 mg/mL，高剂量组为40 mg/mL，试验组中每只试验小鼠灌胃黑蒜多糖提取液1 mL，喂养高血糖饲料。高血糖对照组小鼠给予高血糖饲料喂养，作为黑蒜多糖对外界因素诱导动物机体引发糖尿病保护作用的参照组。空白组不进行黑蒜多糖提取液灌胃，只给予正常的饲料饲养，试验小鼠不摄入任何试验药物。每天测量小鼠的血糖值，得到每组小鼠30 d 的平均血糖。

2 结果与分析

2.1 黑蒜多糖含量测定

根据标准曲线得到黑蒜多糖线性回归方程：y=2.742x-0.006。黑蒜中黑蒜多糖含量为91.68 mg/g，符合本试验中对黑蒜中黑蒜多糖含量的要求，因此本产品黑蒜可用于试验。

2.2 黑蒜多糖提取方法的优化

2.2.1 料液比对黑蒜多糖提取率的影响

从图1 可以看出，随着料液比的降低，黑蒜粗多糖提取率先升高后下降，当料液比为1∶15（g/mL）时，黑蒜粗多糖提取率最高，为8.62%。因此，最佳料液比为1∶15（g/mL）。

图1 料液比对黑蒜多糖提取率的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.2.2 提取时间对黑蒜多糖提取率的影响

由图2 可得，随着提取时间的延长，黑蒜多糖提取率呈先上升后下降的趋势，当提取时间为35 min 时，多糖提取率达到最高，为8.85%。单因素试验显示最佳提取时间为35 min，实验数据曲线为峰型图，但在正交试验中选取适宜试验条件须同时考虑缩短试验时间，提取时间过长会使多糖水解，因此最佳提取时间为30min。

图2 提取时间对黑蒜多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.2.3 提取温度对黑蒜多糖提取率的影响

由图3 可知，随提取温度的升高，多糖提取率呈先上升后下降的趋势，当提取温度为55 ℃时，达到峰值8.96%，因此，最适提取温度为55 ℃。

图3 提取温度对黑蒜多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.2.4 超声功率对黑蒜多糖提取率的影响

由图4 可知，黑蒜多糖提取率随超声功率的增大先增大后减小，当超声功率为400 W 时，提取率最高，为9.35%，因此，最佳超声功率为400 W。试验数据曲线为峰型图，超声功率过高，导致溶液中多糖反渗透进入细胞壁中，使浓度降低，因此，同时考虑节约能源，选取350 W作为正交试验中间量。

图4 超声功率对黑蒜多糖提取率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.3 正交试验

由表2 可知，影响黑蒜多糖提取率的主次因素为D＞A＞C＞B，即超声功率＞提取温度＞提取时间＞料液比。最佳提取条件为A2B2C2D3，即提取温度55 ℃，料液比1∶15，提取时间30 min，超声功率400 W。经验证试验，该条件下黑蒜多糖的平均提取率为9.37%，均优于其他试验组。

表2 黑蒜多糖超声辅助提取的正交试验结果Table 2 Orthogonal test results for ultrasound-assisted extraction of black garlic polysaccharide

2.4 动物实验

2.4.1 黑蒜多糖对高血糖小鼠血糖的影响

经过30 d 的动物实验，五组实验小鼠的血糖平均值如表3 所示。由表可知，在30 d 中，空白组实验小鼠血糖平均值为5.6 mmol/L，符合正常值范围；高血糖对照组血糖为6.5 mmol/L，显著高于正常值水平；低剂量组血糖为6.2 mmol/L，显著高于空白组：中剂量组血糖为5.9 mmol/L，显著高于空白对照组；高剂量组血糖为5.6 mmol/L，为正常值水平；由此可见高剂量组40 mg/mL 黑蒜多糖提取液，对外界因素诱导高血糖反应具有明显的保护作用。

表3 黑蒜多糖对高血糖小鼠血糖的影响Table 3 Effect of black garlic polysaccharide on blood sugar in hyperglycemia mice

2.4.2 黑蒜多糖对高血糖小鼠体质量的影响

表4 为各组小鼠实验30 d 后体质量的比较。由表知，空白组小鼠即正常小鼠质量，高剂量组小鼠体质量与空白组相同，均最高，为24 g，然后依次是中剂量组、低剂量组和高血糖对照组，其中低剂量组、高血糖对照组与空白对照组、高剂量组差异显著。由此可知，高浓度黑蒜多糖提取液能促进高血糖小鼠正常生理代谢，保持正常体质量。

表4 黑蒜多糖对高血糖小鼠体质量的影响Table 4 Effect of black garlic polysaccharide on the body mass of hyperglycemic mice

2.4.3 黑蒜多糖对高血糖小鼠肝质量的影响

表5 为各组小鼠实验30 d 后肝质量的比较。由表知，空白组小鼠肝质量最高，为5.3 g，高剂量组小鼠肝质量接近空白组，然后依次是中剂量组、低剂量组，高血糖对照组小鼠肝质量值最低。根据实验可得，黑蒜多糖提取液可以促进糖尿病小鼠对糖原正常吸收。综上所述，40 mg/mL 的黑蒜多糖提取液对高血糖小鼠具有明显保护作用，多糖提取液浓度为2～40 mg/mL 时，随着提取液浓度逐渐增加，保护作用逐步增强。

表5 黑蒜多糖对高血糖小鼠肝质量的影响Table 5 Effect of black garlic polysaccharide on liver quality in hyperglycemic mice

3 结论

本实验辅以超声波产生的次级效应和机械振动，用水提醇沉的方法提取黑蒜多糖，研究了影响黑蒜多糖提取率的各个因素。经测定该产品黑蒜中多糖含量为91.68 mg/g，符合实验要求。影响黑蒜多糖提取率的主次因素为超声功率＞提取温度＞提取时间＞料液比。最佳提取条件为提取温度55 ℃，料液比1∶15（g/mL），提取时间30 min，超声功率400 W，在此条件下，黑蒜多糖提取率为9.37%。动物实验验证黑蒜多糖对外界因素诱导高血糖动物的保护作用，实验动物设置五组，分别为空白组、高血糖对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。结果显示，黑蒜多糖对外界因素诱导高血糖动物具有保护作用，并且黑蒜多糖提取液浓度为40 mg/mL 时有显著保护作用，经动物实验30 d 后，血糖平均值可达到5.6 mmol/L，符合正常小鼠血糖范围。黑蒜作为大蒜的发酵食品对人体无任何副作用，且具有预防糖尿病，促进机体维持正常血糖的生理功能，本研究为功能性食品黑蒜在降血糖方面的研究提供参考。