兰州百合不同外植体植物组织培养

樊敏唐亚玲王莉马倩吕小旭徐向恩

(1.甘肃医学院，甘肃 平凉 744000；2.平凉市药品检验检测中心，甘肃 平凉 744000)

兰州百合(Lilium davidii var.willmottiae(E.H.Wilson)Raffill)属于百合科百合属单子叶多年生草本植物。兰州百合是甘肃省兰州市特产的地理性标志产物，其色泽洁白如玉，纤维含量较少，味道甜美，具有很高的营养价值和经济价值[1-3]。兰州百合是百合中的上乘之品，是全国唯一的食用甜百合[4]。兰州百合已经成为兰州周边地区带动经济发展的主要支持产业。

现代研究发现，百合中含有甾体皂苷、生物碱、黄酮类成分、苯丙素和多糖类成分[5-10]。百合在治疗疾病方面运用较广泛，如安神助眠、止咳化痰、调节免疫系统、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌，同时还可以降低血糖浓度[10-14]。与此同时，百合还是一个药食两用品。而近年来，市场需求不断增加，种植面积不断增大，但是目前食用百合中存在种源退化严重、连作障碍、病害流行严重、育种工作落后等问题[15]，并已成为将兰州百合推向市场走向世界的阻碍。

近年来，植物组织培养技术已日趋成熟[16-18]，通过对植物进行组织培养，筛选出最佳培养基，促进该植物规模化生产。因此，本研究通过对兰州百合进行植物组织培养，筛选其最佳培养基、最佳消毒时间以及接种方式建立其快速繁殖体系，扩大其生产量，为兰州百合规模化生产提供理论基础及技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

兰州百合新鲜鳞茎、茎、叶。

1.2 方法

1.2.1 培养基

以MS为基本培养基，设置2种不同激素浓度的培养基。

1.2.1.1 诱导愈伤组织及丛生芽培养基

MS培养基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加琼脂8g·L-1；MS培养基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 0.5mg·L-1加蔗糖30g·L-1加琼脂8g·L-1。

1.2.1.2 生根培养基

MS加蔗糖30g·L-1加琼脂6g·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

1.2.2 外植体处理

1.2.2.1 外植体消毒

用毛刷轻轻刷去百合鳞茎、茎、叶上的泥垢后，流水冲洗30min，分别用以下2种方法进行消毒，做好标记。

75%的酒精消毒30s后用0.1%的升汞浸泡12min，中间换1次升汞溶液，最后在无菌室中用无菌水冲洗5～8次；漂白粉过饱和溶液上清液浸泡15min，无菌水冲洗1～2次，75%酒精浸泡1～2s，无菌水冲洗2～3次，0.1%点升汞浸泡8～10min，无菌水冲洗5～8次。

1.2.2.2 外植体接种

将上述消毒好的鳞茎纵切成0.5～1cm2小块，近轴面分别向上、向下放置。茎横切成段平放在培养基表面。叶切为1～2cm2小片放置在培养基上。

1.2.2.3 培养条件

温度25±2℃，光照强度3000lx，光照周期12h/24h。

1.2.3 生根培养

待丛生芽长至3～5cm长时，将已形成的丛生芽转接到生根培养基中，进行生根培养。培养条件，温度27±1℃，光照强度2100～2500lx，光照周期12h/24h。约30d后统计生根率。

1.2.4 炼苗和移栽

生根培养40d左右，待幼根在培养基上长到2～3cm时，进行炼苗。先去掉瓶盖，炼苗2～3d后用镊子取出并用水洗净根部的琼脂，栽入腐殖土∶珍珠岩=1∶1的营养基质中，30d后调查成活率。

2 结果与分析

2.1 不同激素浓度对愈伤组织及丛生芽诱导的影响

表1 不同激素浓度对愈伤组织及丛生芽诱导的影响

在探究激素浓度对愈伤组织及丛生芽诱导的影响时，2,4-D含量过少，诱导的愈伤组织也越少，且愈伤组织生长缓慢。而使用MS加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加琼脂8g·L-1时，愈伤组织生长较快，且长出的愈伤组织呈瘤状突起，愈伤组织约在30～40d后分化为丛生芽。

2.2 不同消毒方法对百合诱导愈伤组织及丛生芽的影响

从表2可以看出，外植体通过漂白粉过饱和溶液上清液处理15min，75%酒精处理2s，0.1%升汞处理9min后，污染率高达73.34%，说明消毒效果不佳，容易被污染。由此可见，最佳消毒方法为75%酒精30s加0.1%升汞10min(中间更换1次升汞溶液)。

表2 不同消毒方法对愈伤组织及丛生芽诱导的影响

2.3 不同外植体对百合愈伤组织及丛生芽诱导的影响

表3 不同外植体对愈伤组织及丛生芽诱导的影响

通过对兰州百合不同部位进行植物组织培养，发现诱导愈伤组织诱导率顺序大小为鳞茎>茎>叶片，且愈伤组织分化为丛生芽的时间也是如此，见图1～4。在以鳞茎为外植体时，放置方式对诱导速度也有影响，近轴面向上放置能更快出现愈伤组织并分化成丛生芽。

2.4 生根培养

由于茎与叶前期愈伤组织诱导效果不佳，因此在转接生根时将鳞茎的丛生芽转接到生根培养基中，生根培养基为MS加蔗糖30g·L-1加琼脂6g·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

表4 丛生芽转接生根表

2.5 炼苗与移栽

幼根在培养基长至2～3cm长时进行炼苗并移栽，移栽入腐殖土∶珍珠岩=1∶1的营养基质中时，需加入百菌清1000倍液以及吡虫啉1000倍液以防生虫、生菌。移栽入营养基质中30d统计成活率时，发现移栽的幼根发育为1～2cm的小鳞茎。将已生根的131株全部移栽，成活数为106，成活率为80.92%。

3 讨论

不同激素浓度对于愈伤组织的诱导具有重要影响，浓度过低诱导率低且丛生芽生长缓慢。诱导愈伤组织及丛生芽的最佳培养基为MS培养基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加琼脂8g·L-1。兰州百合在接种时不同的消毒方式对愈伤组织及丛生芽的诱导影响显著，通过对比，最佳消毒方式为75%酒精30s加0.1%升汞12min(中间换1次升汞溶液)加无菌水冲洗5～8次。不同外植体的诱导率不同，诱导率为鳞茎>茎>叶。除此之外，外植体放置时近轴面向上放置时形成愈伤组织更快。

本试验分别以兰州百合鳞茎、茎、叶为外植体，进行愈伤组织及丛生芽诱导、生根培养、炼苗移栽，建立兰州百合快速繁殖体系，以期增加产量，为规模化生产奠定理论基础。